腎上腺髓質(zhì)素對大鼠肢體缺血再灌注后心肌損傷和細(xì)胞凋亡的影響

(唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)教研室，河北唐山063000)

摘要〔〕目的觀察大鼠肢體缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡情況，探討外源性腎上腺髓質(zhì)素(ADM)對大鼠肢體缺血再灌注(LIR)后心肌損傷的保護(hù)機(jī)制。方法健康雄性Wistar大鼠30只，隨機(jī)分成對照組(Control組)、肢體缺血再灌注4 h組(LIR組)和ADM+ LIR組(ADM組)，每組10只。生化法檢測血漿心肌酶含量；比色法測定心肌組織丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量的變化；免疫組織化學(xué)法檢測心肌組織凋亡蛋白酶Caspase-3蛋白表達(dá)情況；原位末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)檢測心肌凋亡細(xì)胞。結(jié)果與LIR組比較，心肌酶含量下降，心肌組織MDA含量減少，SOD活性增強(qiáng)(P<0.01)；心肌組織Caspse-3蛋白表達(dá)下降，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯下降(P<0.01)。結(jié)論ADM可減輕大鼠LIR后心肌損傷，其機(jī)制可能與抑制心肌氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕再灌注損傷；心肌；凋亡；腎上腺髓質(zhì)素；氧化應(yīng)激

中圖分類號〔〕R363〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展項(xiàng)目(No.12130239b)

1唐山市開灤總醫(yī)院ICU

第一作者：朱娜(1977-),女，碩士，講師，主治醫(yī)師，主要從事肢體缺血再灌注損傷的防治及機(jī)制研究。

肢體缺血再灌注(LIR)可造成肢體以外遠(yuǎn)隔器官損傷。再灌注后氧自由基和炎性因子大量生成，細(xì)胞過度凋亡等因素相互關(guān)聯(lián)，共同影響著遠(yuǎn)隔器官的病理生理過程〔1，2〕。LIR后可造成心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)及代謝改變。尋找防治再灌注后損傷的有效藥物是近年熱點(diǎn)之一。腎上腺髓質(zhì)素(ADM)是內(nèi)源保護(hù)性調(diào)節(jié)肽，具有舒張阻力血管、抑制細(xì)胞凋亡、降低氧化應(yīng)激等作用。文獻(xiàn)證實(shí)外源性應(yīng)用可減輕心肌細(xì)胞死亡，改善心功能〔3〕。本實(shí)驗(yàn)觀察外源性ADM對LIR大鼠心肌損傷及細(xì)胞凋亡的影響，探討ADM對心肌的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組由河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,健康成年雄性Wistar大鼠30只。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為對照組(Control組)、肢體缺血再灌注組(LIR 組)和ADM+ LIR組(ADM組)，每組10只。

1.2 試劑和儀器TUNEL試劑盒、Caspase-3一抗、即用型免疫組化試劑盒等購自北京中山生物制劑公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；ADM試劑由北京康肽生物有限公司提供。Nikon攝影生物光學(xué)顯微鏡：日本日立公司生產(chǎn)；Motic 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)：麥克奧迪儀器儀表有限公司；DF-205恒溫干燥箱：北京西城區(qū)醫(yī)療器械二廠。

董登新指出，其實(shí)大多數(shù)公司停牌的理由都是一樣的：擬籌劃重大事項(xiàng)。其實(shí)，股民也心知肚明，其目的就是躲避股災(zāi)，不過后來復(fù)牌仍躲不過“補(bǔ)跌”，因?yàn)楣蓛r(jià)變動(dòng)是有比價(jià)效應(yīng)的。

1.3 模型制備采用本室常規(guī)方法建立大鼠LIR模型，即用橡皮圈環(huán)繞結(jié)扎大鼠雙后肢根部，阻斷血流4 h后松解，恢復(fù)灌注4 h，于松解前15 min以20%烏拉坦腹腔注射麻醉，固定于解剖臺(tái)上，頸正中部切口分離左側(cè)頸外靜脈插管，注入肝素(1 000 U/kg)抗凝血。ADM組按模型操作，松解前15 min經(jīng)頸外靜脈插管緩慢推注1.0 nmol/kg ADM生理鹽水溶液。Control組雙后肢松弛環(huán)繞橡皮圈，不阻斷血流，LIR組按模型操作，松解前15 min均通過頸外靜脈插管推注4 ml/kg生理鹽水。結(jié)扎時(shí)雙下肢皮膚蒼白，溫度降低觸之冰冷，松開止血帶，皮膚逐漸變紅，局部溫度升高，雙下肢腫脹。經(jīng)激光多普勒血流儀檢測肢體血流情況證實(shí)模型成功。

1.4 標(biāo)本采集與檢測

1.4.1 血清心肌酶測定從腹主動(dòng)脈放血處死動(dòng)物并收集血液，常溫離心后取血漿，HI-TACHI7200全自動(dòng)生化分析儀測定肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量。

1.4.2 心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定取心肌組織加冷生理鹽水制備10%組織勻漿，離心10 min，收集上清液，比色法檢測心肌組織MDA和SOD含量。

1.4.3 心肌組織Caspase-3蛋白水平的測定 心臟經(jīng)濾紙吸干血跡，取心尖部心室肌組織，4%多聚甲醛固定石蠟包埋切片，按免疫組化常規(guī)操作。細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色染色者為陽性細(xì)胞。采用Motic醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件對各組大鼠心肌組織切片進(jìn)行分析，鏡下以相同外部條件攝取圖像，每張隨機(jī)選擇6個(gè)視野，取平均值。

1.4.4 TUNEL法心肌細(xì)胞凋亡的測定 檢測方法嚴(yán)格按說明書操作。細(xì)胞核呈棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，計(jì)算6個(gè)高倍視野下的凋亡細(xì)胞數(shù)及凋亡指數(shù)(AI)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血清心肌酶含量的變化LIR組與Control組比較，血漿CK和CK-MB含量均明顯升高(P<0.01)；給予ADM后，血漿CK和CK-MB含量較LIR組降低(P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠血清CK和CK-MB

與Control組比較：1)P<0.01；與LIR組比較：2)P<0.01；下表同

2.2 各組大鼠心肌組織MDA和SOD含量的變化 LIR組與Control組比較，心肌組織MDA含量升高，SOD含量降低(P<0.01)；給予ADM后，MDA含量較LIR組明顯降低(P<0.01)，但仍高于Control組，SOD含量增高 (P<0.01)。見表2。

表2　各組大鼠心肌組織MDA和

2.3 各組大鼠心肌凋亡的情況變化TUNEL染色可見陽性細(xì)胞核呈棕黃色改變，形態(tài)不規(guī)整。Control未見TUNEL陽性細(xì)胞。心肌細(xì)胞Caspase-3免疫組化染色陽性細(xì)胞主要表現(xiàn)為,心肌細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜呈棕黃色顆?；騽蛸|(zhì)狀。Control組呈弱陽性表達(dá)。LIR組與對照組比較，凋亡細(xì)胞增多，凋亡指數(shù)明顯升高，心肌細(xì)胞Caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。ADM組與LIR組比較，凋亡細(xì)胞減少，凋亡指數(shù)明顯下降,心肌細(xì)胞Caspase-3表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，見表3，圖1、圖2。

表3　各組大鼠心肌組織Caspase-3表達(dá)和

圖1　各組大鼠心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)(DAB,×100)

圖2　各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡(TUNEL,×400)

3討論

LIR損傷是一種多因素綜合作用的復(fù)雜病理過程，再灌注后大量自由基的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡是造成肢體以外遠(yuǎn)隔器官損傷發(fā)生的主要機(jī)制〔1〕。MDA是膜脂質(zhì)過氧化的代謝終產(chǎn)物，其含量反映脂質(zhì)過氧化程度并間接反映自由基的水平。SOD作為體內(nèi)自由基的防御系統(tǒng)，能有效清除氧自由基。本研究表明肢體再灌注后大量氧自由基產(chǎn)生，造成膜脂過氧化，損傷生物膜，心肌酶漏出增多，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相符〔4〕，氧化應(yīng)激是LIR后器官損傷的重要形式。氧自由基的大量生成除直接引發(fā)組織損傷破壞之外也可能作為凋亡誘導(dǎo)的主要因素之一〔5〕。

研究已證實(shí)活性氧可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔6〕?；钚匝鯀⑴c核轉(zhuǎn)錄因子的活化，被激活后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄〔7〕；降低線粒體膜電位，調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起細(xì)胞凋亡〔8，9〕。凋亡是由Caspase家族介導(dǎo)呈級聯(lián)化學(xué)反應(yīng)的過程，調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞增殖與更新間的平衡，維持組織器官正常生理功能及細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定。凋亡是一種基本生理機(jī)制，Caspase-3是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵酶。但凋亡過度則可引起細(xì)胞損傷。本研究顯示再灌注后心肌細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞發(fā)生凋亡樣改變，凋亡細(xì)胞明顯增多。推測肢體缺血再灌注后自由基大量產(chǎn)生并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡加劇，二者共同參與了LIR后心肌損傷過程。

ADM是從人類嗜鉻細(xì)胞瘤組織中提取的一種血管活性肽，具有多種生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)〔10，11〕ADM可抑制細(xì)胞凋亡，ADM基因轉(zhuǎn)染可減少過氧化物的產(chǎn)生和密度，增加心肌cGMP水平提高Bcl-2水平，可通過抑制氧化應(yīng)激減少細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)觀察到再灌注前給予ADM進(jìn)行干預(yù)，血漿中心肌酶漏出減少，心肌組織MDA含量降低，SOD活性升高，心肌細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)下降，凋亡細(xì)胞減少，提示ADM能夠通過降低心肌脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激，從而減少心肌細(xì)胞凋亡。

綜上，LIR后給予ADM可減輕心肌損傷，這一效應(yīng)可能通過改善心肌氧化應(yīng)激狀態(tài)，抑制心肌細(xì)胞的過度凋亡有關(guān)。但具體細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚需探討。

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〔2013-12-13修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)