鋅指蛋白3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)

銀瑞董新偉王錚

(南陽市中心醫(yī)院胸外科，河南南陽473009)

摘要〔〕目的探討鋅指蛋白(ZBED)3在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)及與臨床病理資料的相關(guān)性。方法50對(duì)原發(fā)性肺癌及癌旁組織行免疫組化、熒光定量PCR檢測(cè)ZBED 3蛋白、mRNA的表達(dá)；12對(duì)新鮮肺癌及癌旁組織行Western印跡檢測(cè)ZBED 3蛋白的表達(dá)；統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析不同臨床病理指標(biāo)與ZBED 3表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示ZBED 3表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)及少數(shù)細(xì)胞核，癌細(xì)胞中ZBED 3表達(dá)的陽性率顯著高于癌旁組織(P<0.05)；Western印跡試驗(yàn)證實(shí)ZBED 3在肺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺癌組織mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)；ZBED 3在NSCLC中的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤分化及組織學(xué)類型等無顯著相關(guān)性(P>0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論ZBED 3在NSCLC中過度表達(dá)，并與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕鋅指蛋白3；肺癌；Wnt通路

中圖分類號(hào)〔〕R734.2〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：銀瑞(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事胸外科疾病的臨床診治和基礎(chǔ)研究。

Wnt通路在細(xì)胞的增殖、凋亡、癌變等過程中起重要作用，β-catenin在通路的調(diào)控中處于中心地位，且受Axin復(fù)合體調(diào)控。Axin是一個(gè)腫瘤抑制因子，在細(xì)胞增殖及癌變過程中起關(guān)鍵作用，但Axin的功能需通過其配體作用得以調(diào)節(jié)〔1〕。研究顯示，鋅指蛋白(ZBED)3是一種新的Axin結(jié)合蛋白〔2〕，據(jù)此推測(cè)ZBED3可通過Wnt信號(hào)通路參與機(jī)體的重要生理病理過程。本課題研究ZBED3在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)及其臨床意義。

1材料與方法

1.1材料50對(duì)原發(fā)性肺癌及癌旁組織來于南陽市中心醫(yī)院胸外科2012年6月至2014年6月手術(shù)切除標(biāo)本?；颊咝g(shù)前均未接受放、化療，年齡35～78歲，男35例，女15例。肺癌組織學(xué)分型及分級(jí)依據(jù)WHO2004版分類標(biāo)準(zhǔn)，其中鱗癌21例，腺癌29例；高分化12例，中分化20例，低分化18例；腫瘤臨床分期依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)2011年TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期8例，Ⅱ期20例，Ⅲ期21例，Ⅳ期1例。另取12對(duì)新鮮肺癌及癌旁組織快速冷凍于-70℃保存，用于Western印跡檢測(cè)。

1.2免疫組化檢測(cè)NSCLC及癌旁組織ZBED3的表達(dá)中性甲醛溶液固定肺癌及癌旁組織標(biāo)本，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為4μm，經(jīng)脫蠟、脫苯、水化后，行抗ZBED3免疫組化染色，按鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法試劑盒說明書步驟進(jìn)行。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照，結(jié)果判定：ZBED3染色部位為細(xì)胞質(zhì)，觀察染色強(qiáng)度(I)及范圍(S)，Ⅰ分為強(qiáng)、中及弱三個(gè)級(jí)別，棕黃色顆粒且深染為強(qiáng)表達(dá)(3分)，淡黃色無顆粒染為弱表達(dá)(1分)，中度表達(dá)介于二者之間(黃染顆粒狀、2分)；S≥10%為陽性，并分為0～4四個(gè)等級(jí)，其中<10%記為0分，代表陰性，10%≤S≤25%為1分，25%

1.3熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定ZBED3mRNA的表達(dá)取等量肺癌及癌旁組織，采用Trizol法提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用熒光染料通過實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)ZBED3mRNA的表達(dá)，引物序列：5′-ACTGGGCACGCCTGTTGG-3′和5′-CGGGGCTCTGCTTCTTTA-3′，β-actin為內(nèi)參，引物序列：5′-GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′和5′-GATGTCACGCACGATTTC-3′，用2-△△Ct計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

1.4Western印跡檢測(cè)NSCLC及癌旁組織ZBED3的表達(dá)取等量肺癌及癌旁組織，加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑，4℃充分裂解30min，低溫12 000r/min離心35min，取上清，利用二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白濃度；每泳道加約60μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳，經(jīng)濕轉(zhuǎn)于聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，依次加入稀釋的抗ZBED3抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗并依次洗脫，加入化學(xué)發(fā)光試劑，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像檢測(cè)，利用QuantityOne軟件進(jìn)行圖像灰度值分析，以各目的與內(nèi)參條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2、t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1在NSCLC及癌旁組織中ZBED3免疫組化及Western印跡結(jié)果免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示ZBED3表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)及少數(shù)細(xì)胞核，在癌細(xì)胞中ZBED3表達(dá)的陽性率為62%(31/50)，顯著高于癌旁組織10%(5/50)(P<0.05)。Western印跡試驗(yàn)證實(shí)ZBED3在肺癌組織中的表達(dá)(60.8%±3.1%)顯著高于癌旁組織(20.3%±1.6%)(P<0.05)。

2.2ZBED3與臨床病理之間的相關(guān)性ZBED3在NSCLC中的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤分化及組織學(xué)類型等無顯著相關(guān)性(P>0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1　 ZBED 3與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系(n)

2.3在NSCLC及癌旁組織中ZBED3mRNA表達(dá)量NSCLCZBED3mRNA表達(dá)水平(1.021±0.001)明顯高于癌旁組織(0.104±0.002)(P<0.05)。

3討論

鋅指蛋白家族對(duì)DNA、蛋白質(zhì)及RNA的識(shí)別和結(jié)合有一定的作用，ZBED3是鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白家族的一名成員〔2〕，含有鋅指的DNA結(jié)構(gòu)域，可介導(dǎo)蛋白和DNA的結(jié)合，其基因位于人類第5號(hào)染色體上。人類ZBED3 蛋白由234個(gè)氨基酸組成，蛋白質(zhì)分子量約為25kD〔3〕，利用基因芯片技術(shù)已發(fā)現(xiàn)ZBED3在人體組織中廣泛表達(dá)〔4〕。

Wnt信號(hào)通路是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)，參與細(xì)胞的調(diào)控、增殖、凋亡等〔1〕。Wnt信號(hào)通路是由Wnt蛋白及其受體、調(diào)節(jié)蛋白等組成的復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其異常激活與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移非常密切，主要由Wnt分子、Axin、GSK3β、β-catenin等組成〔5〕。β-catenin是Wnt通路正向調(diào)節(jié)的重要效應(yīng)分子，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)降解失常，可在細(xì)胞核內(nèi)累積激活一系列靶基因轉(zhuǎn)錄而形成腫瘤〔1〕。Axin為Wnt/β-catenin途徑的重要調(diào)節(jié)因子，可使細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin磷酸化及降解，從而負(fù)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路，Axin表達(dá)或功能喪失可能是惡性腫瘤增殖的重要因素之一〔2〕。Tamai等〔6〕在研究低密度脂蛋白(LDL)受體相關(guān)蛋白(LRP)5、6的過程中，發(fā)現(xiàn)其能夠與Axin相互作用并抑制其活性，從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)；Chen等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)與LRP5、6功能相近的鋅指蛋白ZBED3與Axin結(jié)合后，抑制Axin介導(dǎo)的糖原合成酶激酶對(duì)β-鈣黏著蛋白的磷酸化并激活Wnt信號(hào)，促進(jìn)腫瘤形成。

目前關(guān)于ZBED3在肺癌中的表達(dá)研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常肺組織，ZBED3在NSCLC中過表達(dá)，并與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，這提示ZBED3可能為維持NSCLC惡性表型的重要分子，并可能成為臨床治療的潛在靶點(diǎn)。

4參考文獻(xiàn)

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2PeastonAE，KnowlesBB，HutchisonKW.Genomeplasticityinthemouseoocyteandearlyembryo〔J〕.BiochemSocTrans，2007；35(3)：618-22.

3CuiT，ZhangP，GuoX，et al.TheexpressionandsignificanceofZincfingerproteinZBED3inmouseoocyte〔J〕.ActaUniversitatisMedicinalisNanjing(NaturalScience)，2011；31(9)：1-4.

4FanC，JiangGY，ZhangXP，et al.Zbed3contributestomalignantphenotypeoflungcancerviaregulatingβ-cateninandP120-catenin1〔J〕.MolCarcinog，2015;54(S1):E138-E147.

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6TamaiK，SemenovM，KatoY，et al.LDL-receptor-relatedproteinsinWntsignaltransduction〔J〕.Nature，2000;407(6803)：530-5.

7ChenT，LiM，DingY，et al.Identificationofzinc-fingerBEDdomain-containing3 (Zbed3)asanovelAxin-interactingproteinthatactivatesWnt/β-cateninsignaling〔J〕.JBiolChem，2009;284(11)：6683-9.

〔2015-03-09修回〕

(編輯袁左鳴)