·心腦血管及代謝性疾病·

阿爾茨海默病相關的生物信息學分析

高慧麗王笑寒李燕飛段冉冉滕軍放彭濤賈延劼

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經內科，河南鄭州450052)

摘要〔〕目的探討阿爾茨海默病(AD)發(fā)生發(fā)展相關的基因。方法①利用生物信息學方法挖掘現有文獻,NLP分析方法進行關于AD文獻挖掘。②Gene Ontology(GO)分析方法進行相關基因功能分類。③Pathway分析方法統計基因在每個Pathway中的富集程度。④基因網絡分析方法將上述三種結果整合為基因間的相互關系網絡，并篩選出AD相關信號轉導通路中的樞紐基因(Hub基因)。 結果與AD發(fā)生發(fā)展相關的文獻和基因分別為8 900篇和898個，繪制與AD發(fā)生發(fā)展有關的相關基因的生物信號網絡，發(fā)現AD相關基因的表達參與到14種生物學過程、12種細胞的組成和25個不同的信號轉導通路(P<0.01)，執(zhí)行9種生物分子功能，并與24種疾病(P<0.01)的發(fā)生發(fā)展有關。研究基因/蛋白質相互作用發(fā)現，PIK3CG等21個為AD相關基因網絡中連接程度最高的21個基因(P<0.05)，即Hub基因。結論文獻挖掘得到的相關信號通路(Cytokine-cytokine receptor interaction信號通路)及Hub基因(PIK3CG、CBL)與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關。

關鍵詞〔〕阿爾茨海默?。簧镄畔W；信號通路；Hub基因

Related bioinformatics analysis of Alzheimer's disease

GAO Hui-Li,WANG Xiao-Han,LI Yan-Fei,etal.

Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,Henan,China

Abstract【】ObjectiveTo discuss the genes that related with the development of Alzheimer's disease(AD) on the basis of the existing literature by bioinformatics methods.Methods①NLP analysis was used to gather genes related with AD.②All of these genes obtained from NLP analysis were classified in 3 functional groups by gene ontology(GO)analysis.③The enrichment P-value of genes was calculated for each pathway by pathway analysis.④Gene network analysis method was used to integrate the results of these three into the relationship network of genes and Filter out the Hub genes in the AD-related signal transduction pathway.ResultsGet 8 900 literatures and 898 genes that related with the development of AD were gotten,the expression of genes related to AD were involved in 14 kinds of biological processes,12 kinds of cellular components and 25 different signal transduction pathways(P<0.01),performed 9 biomolecular function,related to the development 24 kinds of diseases(P<0.01) by drawing the biological signaling network of these genes.Connectivity analysis was carried out and found that the connectivity of 21 genes(P<0.05) were the highest.ConclusionsSignaling pathway like cytokine-cytokine receptor interaction and genes such as PIK3CG,CBL which obtained through literature mining are closely associated with the development of AD.

【Key words】Alzheimer's disease;Bioinformatics;Signal pathway;Hub gene

第一作者：高慧麗(1988-)，女，在讀碩士，主要從事腦血管疾病研究。

2013年美國阿爾茨海默病(AD)患者約有520萬，其中大于65歲的患者約有500萬〔1〕。隨著人類壽命的延長，每年約有100萬新發(fā)病例，到2050年，預計AD患者將達到1 380萬，是目前患病人數的3倍〔1〕。雖然在過去的30年有大量針對AD的癥狀、發(fā)病原因、危險因素和治療的研究，但是AD的發(fā)病原因、發(fā)病機制尚不十分明確?，F有研究表明，Aβ、Tau、PS和ApoE等均在AD的發(fā)病過程中起到重要作用〔2〕，但上述幾個方面作為靶點的治療未取得良好效果。本研究利用生物信息學方法采集與AD發(fā)生發(fā)展相關的基因，并整合成為相關基因間的關系網絡，篩選相關信號通路及樞紐基因(Hub 基因)。

1材料與方法

1.1數據信息分析內容利用上海敏芯文獻挖掘分析系統(軟件著作權登記號：2009SR045504)，以“Alzheimer’s Disease”進行文獻挖掘及生物信息學分析找到近十年的human的信息。挖掘出與關鍵詞相關的所有基因形成列表；進行gene ontology、pathway和network分析。

1.2數據信息分析方法

1.2.1NLP 分析NLP的具體步驟是：①Document searching & formating:即文檔搜索和格式化，首先利用關鍵詞進行文檔搜索，然后將搜索到的文檔整理成XML格式。②Gene mention tagging using ABNER:基因的描述的定位是利用ABNER軟件進行的。③Conjunction resolution:關于提取的基因的描述中,如將“STAT3/5 gene”解析成為STAT3 gene和STAT5 gene。④Gene name normalization based on Entrez database:由于基因的名字在自由文本中比較混亂，為了方便分析和比較，將統一應用官方基因符號對文章中的基因進行描述。以NCBI的entrez gene數據庫中的基因符號為準。⑤Statistical analysis:統計每個基因出現的頻率。一個基因出現的頻率越高，則該基因與本疾病相關的可能性越大。將PubMed數據庫文獻總數記作N，在PubMed文獻數據庫中基因和相應疾病分別獨立出現的頻率，分別記作m,n。假設實際中基因-疾病同時出現的次數為k，那么利用超幾何分布，可以計算出在完全隨機的條件下出現大于k次co-citation的概率

其中

1.2.2Gene ontology (GO)分析GO數據庫包括三方面功能信息，分別是基因參與的生物過程，所處的細胞位置，發(fā)揮的分子功能，并將各種功能概念組織成DAG(有向無環(huán)圖)的結構。GO是一個使用有控制的詞匯表和嚴格定義的概念關系，將各物種的基因功能分類體系以有向無環(huán)圖的形式進行統一表示，從而將基因的功能信息進行較全面地概括，對傳統功能分類體系中常見的維度混淆問題進行糾正。在基因表達譜分析中，基因功能分類標簽和基因功能研究的背景知識常由GO提供。利用GO的知識體系和結構特點能夠發(fā)掘與基因差異表達現象關聯的單個特征基因功能類或多個特征功能類的組合。在本實驗中，將靶基因向GO數據庫的各節(jié)點映射。計算每個節(jié)點的基因數目。軟件使用R(http://www.r-project.org/)統計平臺下的GSEABase軟件包。按照生物學過程(biological process)，細胞組成(cellular component)，分子功能(molecular function)三種獨立的方式對差異表達的基因進行分類。

1.2.3基因通路及網絡分析使用GenMAPP v2.1將基因向KEGG pathway數據庫映射，進而統計基因在每個pathway中的富集程度(enrichment p-value)。同時整合 3 種不同的相互作用關系：1)KEGG數據庫中基因之間的蛋白互做、基因調控、蛋白修飾等關系；2)已有的高通量實驗，如酵母雙雜交等證實的蛋白-蛋白相互作用；3)已有文獻報道的中提到的基因之間的相互作用。具體來講，下載KEGG數據庫中pathway數據，通過R(http://www.r-project.org/)下的KEGGSOAP (http://www.bioconductor.org/packages/2.4/bioc/html/KEGGSOAP.html)軟件包，分析基因組范圍內的基因之間的相互作用，包括3種關系(表1)。蛋白-蛋白相互作用數據下載自MIPS數據庫(http://mips.helmholtz-muenchen.de/proj/ppi/)。co-cition算法被應用于已有文獻報道的基因之間的相互作用?；痉椒ㄊ牵簩ubMed數據庫的文獻摘要下載到本地，將每個摘要分解為句子，然后分析每個句子中共同存在的基因名稱，即co-citation的基因。對于每對co-citation的基因，統計該基因對出現的頻率?；驅Τ霈F的頻率越高，則基因間存在相互作用的可能性越大。將PubMed數據庫文獻總數記作N，在PubMed文獻數據庫中基因對中的兩個基因分別獨立出現的頻率，分別記作m，n。假設實際中基因對同時出現的次數為k，k么利用超幾何分布，可以計算出在完全隨機的條件下出現大于 次co-citation的概率：

其中

最后，將以上三種數據結果進行綜合考慮，并將其整合為基因間的相互關系網絡。通過medusa軟件對該網絡進行圖形展示。通過構建基因網絡，可以使基因之間的相互關系在全局的水平上得到直觀的反應，同時也能反映基因調控網絡的穩(wěn)定性。Hub基因即是在網絡中連接度高的基因。這些基因往往對網絡的穩(wěn)定性起到重要作用。一般認為Hub基因的重要性要高于普通基因，因為Hub會影響大部分基因，是基因調控的核心。一般來講，大部分Hub基因都是轉錄因子，有的時候，也可能是激酶，如MAPK系統。

2結果

關鍵詞2.1文本挖掘程序分析結果利用搜索，共找到AD相關基因的文獻8 900篇。利用文本挖掘程序分析后共獲取相關gene 898個(表2)。目前，文本挖掘在生物醫(yī)學領域發(fā)揮著重要的作用，主要是從文獻中抽取基因、蛋白、藥物、疾病等生物實體之間的關系。因此，可以進一步分析得到的 898個相關基因以篩選出本研究感興趣的基因。

中圖分類號〔〕R741〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81071114)

通訊作者：賈延劼(1971-)，男，博士生導師，主任醫(yī)師，教授，主要從事腦血管疾病基礎及臨床研究。

2.2AD 相關基因的生物學功能采用GO分析，將所有AD相關基因歸類到①生物學過程(表 3)，②細胞組成(表4)，③分子功能(表5)三種生物學關系中。結果顯示：AD相關基因主要參與細胞發(fā)展過程、細胞信號轉導、物質運輸等生物學過程；AD相關基因的產物主要參與細胞膜、胞核及胞外非組織的構造等細胞組分；最后，AD相關基因主要發(fā)揮調節(jié)細胞信號轉導、核酸結合、激酶活性和轉錄調控活動等分子功能。

2.3基因信號通路和網路分析通過pathway分析，得到生物信號通路共62條，其中有具有統計學意義的信號通路有25條(P<0.01)(表6)，并且發(fā)現Cytokine-cytokine receptor interaction信號通路、MAPK信號通路、趨化因子信號通路等與AD相關程度最高；同時找出與這些基因相關的24種疾病(P<0.01，表7)包括前列腺癌、肌萎縮側索硬化癥、慢性粒細胞白血病、結直腸癌、膠質瘤等。最后通過整合ECrel、PPrel 和GErel三種關系，繪制出AD相關基因的信號轉導網絡圖(圖1)，發(fā)現PIK3CG、CBL、GNAI1、JAK2、JUN、PIK3R3、CCND1、CCR1、CCR2、CCR3、CCR5、CX3CR1、CXCR4、EGFR、IL8RB、MAPK1、MAPK3、CTNNB1、MYC、FGFR2和GRB2這21個基因在信號通路中的鏈接程度最高(P<0.05)，被定義為Hub基因。并進行連接度分析，通過連接度分析發(fā)現連接度最高的為PIK3CG(P=0.000 373)，其中有意義的互作基因共有17個：CBL,CD28,DNM1L,DNM2,EGFR,ERBB4,FGFR2,GAB2,GNAI1,GNB4,IRS1,JAK2,MAP2K1,MAP2K2,NGFR,PDPK1,PTPN11。

表1　基因網絡分析基因組范圍內的基因之間的相互作用

表2　檢測AD相關基因部分列表

表3　AD相關基因功能分類之生物學過程

表4　AD相關基因功能分類之細胞組成

表5　AD相關基因功能分類之分子功能

表6　AD相關基因相關的信號通路

圖1　AD相關基因間的相互關系網絡 (連接邊：粉紅色=活化，藍色=抑制，黃色=結合)

名稱數目P值1 2型糖尿病120.0037749272 1型糖尿病140.0001165073 AD469.31×10-104 肌萎縮側索硬化癥(ALS)2805 朊蛋白病152.02×10-66 幽門螺桿菌感染150.005771717 腫瘤通路721.84×10-98 結直腸癌246.13×10-69 腎細胞癌160.00303672710 胰腺癌205.71×10-511 子宮內膜癌225.64×10-912 神經膠質瘤231.40×10-713 前列腺癌311.38×10-914 甲狀腺癌122.38×10-515 黑色素瘤204.58×10-516 膀胱癌222.11×10-1117 慢性粒細胞白血病251.53×10-718 急性髓細胞性白血病177.74×10-519 小細胞肺癌200.00076554620 非小細胞肺癌191.92×10-621 哮喘123.58×10-522 自身免疫性甲狀腺疾病130.00319214723 同種異體移植物排斥138.41×10-524 移植物抗宿主反應130.000274878

3討論

AD是全球癡呆最常見的類型，其主要的組織病理學特征為：在人腦中，細胞內神經原纖維纏結以及細胞外淀粉樣斑塊沉積。細胞內神經原纖維纏結主要是由微管相關蛋白-Tau蛋白過度磷酸化形成。在正常組織中，Tau蛋白是微管蛋白的重要成分，對細胞內神經營養(yǎng)物質運輸、囊泡、線粒體和常染色體的結構起到重要的支持作用，也是神經軸突生長發(fā)展的必要物質〔3〕。AD患者腦組織中Tau蛋白異常過度磷酸化，形成不溶性纖維并沉積在細胞內。Aβ肽的纖維聚集物是淀粉樣斑塊的重要組成成分，Aβ肽是過表達的淀粉樣前體蛋白(APP)的代謝產物，Aβ的生成是AD的重要病理過程。許多研究表明，Tau蛋白和Aβ的生成異常都可能會引起神經元突出功能和線粒體功能紊亂，并導致AD的神經退行性變。很多其他的病理機制也與神經元纖維纏結和淀粉樣斑塊沉積相關，比如炎癥反應〔4〕、氧化損傷〔5〕、線粒體功能障礙〔6〕等。

基因和環(huán)境因素在AD的發(fā)病過程起到重要作用。研究表明，具有陽性家族史者多呈常染色顯性遺傳和多基因遺傳，目前發(fā)現的突變基因主要是APP、PSEN1、PSEN2和APOE，且前三個基因多與早發(fā)性AD相關，而第四個基因多與遲發(fā)性AD相關，與散發(fā)性AD也有一定的相關性。可以看到，本次文獻挖掘得到了與AD發(fā)生、發(fā)展相關的898個基因，除了目前研究較多的APP、PSEN1、PSEN2、APOE、Tau蛋白編碼基因(MAPT)、裂解酶編碼基因(BACE)等基因外，還包括一些其他的基因，有待于進一步深入研究。

繪制與AD發(fā)生發(fā)展相關基因的生物信號網絡，發(fā)現AD相關基因的表達參與到25個不同的信號轉導通路(P<0.01)，并與24種疾病(P<0.01)的發(fā)生發(fā)展有關。多項研究表明，AD患者的大腦組織中有一個重要的神經病理學特征，即腦組織中的慢性炎癥反應過程〔7,8〕，盡管伴發(fā)腦組織損傷的炎癥反應也存在于其他神經疾病中，如帕金森病〔9〕、肌萎縮側索硬化癥〔10〕等，但是AD與慢性炎癥之間的關系是與之不同的。流行病學研究發(fā)現慢性炎癥可能是AD眾多病因中的一個，長期應用大劑量非甾體類抗炎藥(NSAIDs)可以降低AD發(fā)病概率〔11〕。在生物化學方面，可以發(fā)現AD患者腦組織中IL-1,IL-6,TNF-α和 S100β等細胞因子增多〔8〕。慢性炎癥反應可加速AD的發(fā)生和惡化。有研究表明，多種炎癥因子、抗炎因子及趨化因子及其受體可能通過細胞因子-細胞因子受體相互作用通路信號通路、趨化因子信號通路在AD的病理學過程中發(fā)揮重要作用〔12〕，同時也通過影響Aβ及Tau生成的過程參與AD的病理過程〔13〕；絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是近年來發(fā)現的廣泛存在于各種動物細胞的一條信號轉導途徑，對于細胞周期的運行和基因表達具有重要的調控作用，MAPK信號通路也與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關〔14，15〕。

通過構建基因網絡，可以使基因之間的相互關系在全局的水平上得到直觀的反應，同時也能反映基因調控網絡的穩(wěn)定性。Hub基因即是在網絡中連接度高的基因。這些基因往往對網絡的穩(wěn)定性起到重要作用。一般認為Hub基因的重要性要高于普通基因，因為Hub會影響大部分基因，是基因調控的核心。故本研究將898個基因進行了網絡構建及連接度分析。PIK3CG基因定位于7q22.3，長 37 kb，,包含 10 個外顯子，其編碼磷脂酰肌醇-3激酶PI3K其中的一個催化亞基，PI3K屬于磷脂激酶家族，PI3K/Akt信號通路參與多種生物學過程，此通路的激活可以防止Aβ對神經細胞的毒性作用〔16〕。PIK3CG基因也通過影響Aβ的生成而與AD密切相關〔17〕。除此之外，其他的Hub基因如CBL〔18〕、JAK2〔19〕等也與AD的發(fā)生發(fā)展相關。

本研究對AD發(fā)生發(fā)展機制研究有較重要參考價值。但是，目前關于AD相關基因和信號通路的研究不多，對其的認識還很有限，未來需要更多更深入的研究來具體闡述相互之間的聯系，從而幫助臨床醫(yī)生進行早期、有效的診斷和預防，為AD患者制定個體化治療方案，提高AD患者的治療效果。

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〔2014-03-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)