Akt-GSK3β細(xì)胞信號(hào)通路在血管性癡呆大鼠認(rèn)知障礙中的作用機(jī)制

趙雪艷

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南開封475000)

摘要〔〕目的探討Akt-GSK3β細(xì)胞信號(hào)通路在血管性癡呆大鼠認(rèn)知障礙中的作用機(jī)制。方法通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)以及生化指標(biāo)測定比較模型組和正常組的差異，分析Akt-GSK3β細(xì)胞信號(hào)通路的作用機(jī)制。結(jié)果模型組逃避潛伏期、通過原平臺(tái)次數(shù)、原平臺(tái)所在象限停留百分比與正常組差異顯著(P<0.05)；模型組的反應(yīng)時(shí)間、學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)、潛伏時(shí)間、記憶錯(cuò)誤次數(shù)與正常組差異顯著(P<0.05)；術(shù)后2、4、6 w模型組視野內(nèi)正常神經(jīng)元數(shù)目均明顯低于同時(shí)期的正常組；術(shù)后2 w、術(shù)后4 w模型組的p-Akt蛋白表達(dá)和p-GSK-3β蛋白表達(dá)明顯高于同時(shí)期正常組(P<0.05)。結(jié)論對于血管性癡呆大鼠，Akt-GSK3β細(xì)胞信號(hào)通路可調(diào)控細(xì)胞凋亡，在保護(hù)神經(jīng)元和改善認(rèn)知的過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞〔〕血管性癡呆；信號(hào)通路

中圖分類號(hào)〔〕R743〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：趙雪艷(1975-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病、神經(jīng)免疫學(xué)研究。

血管性癡呆(VD)是由于出血性腦血管病、缺血性腦血管病等導(dǎo)致的持續(xù)性、獲得性智能障礙綜合征，主要臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶功能障礙〔1～3〕。在我國，腦血管病呈逐年上升的趨勢，VD作為老年期癡呆的主要組成部分給人們帶來嚴(yán)重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)〔4,5〕。研究表明腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可激活下游Akt-GSK3β信號(hào)通路發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，保護(hù)神經(jīng)元。本研究探討Akt-GSK3β細(xì)胞信號(hào)通路在VD大鼠認(rèn)知障礙中的作用機(jī)制。

1資料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8月齡昆明種大鼠，雌雄各半，體重(21±2)g。實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，飼養(yǎng)于通風(fēng)、干燥、安靜的環(huán)境中，普通飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前為排除有游泳障礙的動(dòng)物，將大鼠放入水迷宮內(nèi)自由游泳30 s。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組將動(dòng)物隨機(jī)分成正常組30只和模型組30只，正常組、模型組根據(jù)不同時(shí)期分為術(shù)后2 w、4 w、6 w三個(gè)小組，每組10只，共30只。

1.2.2模型制備大鼠腹腔注射350 mg/kg 10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，頸部消毒，切開頸部皮膚及皮下組織，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用4號(hào)絲線同時(shí)結(jié)扎阻斷雙側(cè)血流20 min，之后松開絲線恢復(fù)血流10 min，然后再次阻斷20 min，恢復(fù)10 min，如此進(jìn)行3次。相當(dāng)于進(jìn)行3次20 min缺血，3次10 min再灌注。大鼠心跳、呼吸平穩(wěn)后縫合皮膚，正常飼養(yǎng)72 h后不死亡就作為模型組。

1.2.3行為學(xué)測試術(shù)后對正常組和模型組進(jìn)行行為學(xué)測試，分別為Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，測試均在光線偏暗、安靜的環(huán)境下進(jìn)行。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：水迷宮主要由一個(gè)一個(gè)圓形水池和可移動(dòng)位置的平臺(tái)組成。水池高45 cm，直徑80 cm，平臺(tái)直徑6 cm。注入清水到水池中至水深30 cm，平臺(tái)低于水面1 cm。加入牛奶使池水變?yōu)椴煌该魅榘咨?，使大鼠無法看到乳白色平臺(tái)。將水池平均分為4個(gè)象限，任選的一個(gè)象限把平臺(tái)放置于中央。測試內(nèi)容包括：①定位航行實(shí)驗(yàn)：每天上、下午各1次，歷時(shí)4 d，每個(gè)象限均進(jìn)行1次。選擇任一象限將大鼠面向池壁放入水中，大鼠找到平臺(tái)后記錄時(shí)間，即為逃避潛伏期。讓大鼠在平臺(tái)上休息15 s，如果60 s后還無法找到平臺(tái)，幫助大鼠上平臺(tái)休息15 s。休息之后按順時(shí)針順序到下一個(gè)象限進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。②空間探索實(shí)驗(yàn)：第5天把平臺(tái)撤除，從任一點(diǎn)將大鼠放入水中，觀察60 s內(nèi)大鼠在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間百分比，計(jì)算通過原平臺(tái)位置次數(shù)和。

跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)：被動(dòng)回避反應(yīng)箱為10 cm×10 cm×40 cm，箱底放置可通電銅柵，銅柵直徑3 mm。反應(yīng)箱一角距離箱底4.5 cm處放置一直徑為4.5 cm的絕緣橡皮墊，作為回避電擊的安全臺(tái)。先將大鼠放入箱內(nèi)適應(yīng)3 min，之后給銅柵通36 V交流電，持續(xù)5 min。每天上、下午各1次，歷時(shí)4 d，記錄大鼠受電擊后第一次找到安全臺(tái)的時(shí)間作為反應(yīng)時(shí)間，5 min內(nèi)跳下安全臺(tái)的次數(shù)作為學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)。第5天直接將大鼠放在安全臺(tái)上，同時(shí)給銅柵通電，持續(xù)5 min。記錄大鼠第一次從安全臺(tái)跳到銅柵上的時(shí)間作為潛伏時(shí)間，5 min內(nèi)跳下安全臺(tái)的次數(shù)作為記憶錯(cuò)誤次數(shù)。

1.2.4正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)兩項(xiàng)行為學(xué)檢測結(jié)束后，立即斷髓處死大鼠，迅速取出腦組織，制備石蠟組織標(biāo)本。每只大鼠選取2張相同部位的切片，在10×40倍光鏡下觀察海馬CA1區(qū)的2個(gè)連續(xù)視野，計(jì)算各視野正常神經(jīng)元數(shù)目。神經(jīng)元正常標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核無細(xì)胞皺縮和水腫表現(xiàn)、呈圓形或橢圓形。

1.2.5術(shù)后p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表達(dá)標(biāo)本選取自斷髓處死大鼠的海馬組織，提取蛋白，應(yīng)用Western印跡技術(shù)檢測p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表達(dá)，試劑分別使用p-Akt Ser473抗體、GSK-3β抗體和p-GSK-3β Ser9抗體。p-Akt為活化Akt，p-GSK-3β為磷酸化GSK-3β。以術(shù)后2 w正常組數(shù)據(jù)為1，各組P-AKt、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達(dá)與術(shù)后2 w正常組的比值作為其表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件行t及χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1兩組大鼠行為學(xué)測試結(jié)果比較模型組的逃避潛伏期明顯高于正常組(P<0.05)；模型組通過原平臺(tái)次數(shù)、原平臺(tái)所在象限停留百分比明顯低于正常組(P<0.05)。見表1。模型組的反應(yīng)時(shí)間、學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)、記憶錯(cuò)誤次數(shù)明顯高于正常組(P<0.05)；模型組的潛伏時(shí)間明顯低于正常組(P<0.05)。見表2。

2.2兩組大鼠腦組織正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)比較術(shù)后2 w、術(shù)后4 w、術(shù)后6 w模型組視野內(nèi)正常神經(jīng)元數(shù)目均明顯低于同時(shí)期的正常組(P<0.05)。見表3。

2.3各組p-Akt蛋白表達(dá)術(shù)后2 w、術(shù)后4 w模型組的p-Akt蛋白表達(dá)明顯高于同時(shí)期的正常組(P<0.05)；術(shù)后6 w模型組的p-Akt蛋白表達(dá)與同時(shí)期的正常組的差異不明顯(P>0.05)。見表4。

表1　兩組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

表2　兩組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

表3　兩組大鼠腦組織正常神經(jīng)元數(shù)目比較 ± s, n=10)

表4　兩組術(shù)后p-Akt蛋白表達(dá)的比較

2.4各組GSK-3β蛋白表達(dá)術(shù)后2 w、術(shù)后4 w、術(shù)后6 w模型組的GSK-3β蛋白表達(dá)與同時(shí)期的正常組的差異不明顯(P>0.05)。見表5。

表5　兩組術(shù)后GSK-3β蛋白表達(dá)的比較

2.5各組p-GSK-3β蛋白表達(dá)術(shù)后2 w、術(shù)后4 w模型組的p-GSK-3β蛋白表達(dá)明顯高于同時(shí)期的正常組(P<0.05)；術(shù)后6 w模型組的p-GSK-3β蛋白表達(dá)與同時(shí)期的正常組的差異不明顯(P>0.05)。見表6。

表6　兩組術(shù)后p-GSK-3β蛋白表達(dá)的比較

3討論

VD會(huì)嚴(yán)重影響患者的日常生活能力、生活質(zhì)量和社會(huì)職業(yè)功能，增加醫(yī)藥費(fèi)用，縮短患者壽命，加重家庭和社會(huì)的負(fù)擔(dān)，其主要表現(xiàn)為語言、記憶、認(rèn)知能力、視覺功能、人格或情商等方面的改變，特別是以高級(jí)認(rèn)知功能減退、記憶喪失為主〔5～8〕。癡呆已經(jīng)成為繼腦卒中、癌癥和心血管病之后的第四大死亡殺手〔9〕。

短暫性腦缺血可導(dǎo)致靜止性梗死、細(xì)胞凋亡、選擇性神經(jīng)元壞死，如果出現(xiàn)反復(fù)發(fā)生的情況，會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知下降。由缺血再灌注誘導(dǎo)的損傷會(huì)導(dǎo)致炎性反應(yīng)，作為神經(jīng)生長因子的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)在腦缺血時(shí)會(huì)出現(xiàn)增高，結(jié)合細(xì)胞膜表面的酪氨酸激酶受體B(TrkB)，從而激活下游的PI3K-Akt信號(hào)通路。文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，腦缺血后的神經(jīng)元凋亡過程中有PI3K-Akt信號(hào)通路的參與，學(xué)習(xí)記憶與PI3K-Akt信號(hào)通路存在密切相關(guān)性〔10〕。PI3K-Akt信號(hào)通路是細(xì)胞中一種重要的存活/凋亡途徑，參與細(xì)胞有絲分裂、分化、遷移和存活〔11〕。GSK-3是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有多種功能〔12〕。GSK-3α和GSK-3β是GSK-3主要的2種亞型，GSK-3β屬于Akt下游主要靶激酶之一，包含十幾種轉(zhuǎn)錄因子，可磷酸化幾十種蛋白，是細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的重要組成成分。GSK-3β誘導(dǎo)凋亡途徑主要包括：抑制促存活轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)促凋亡轉(zhuǎn)錄因子；激活凋亡相關(guān)蛋白激酶；磷酸化eIF2B而抑制蛋白合成。PI3K-Akt信號(hào)通路在調(diào)控凋亡過程中會(huì)對GSK-3β產(chǎn)生很大的影響，GSK-3β的Ser9位點(diǎn)會(huì)被激活的Akt磷酸化，下調(diào)GSK-3β的活性，磷酸化β連環(huán)蛋白，促進(jìn)細(xì)胞生存。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過反復(fù)腦缺血再灌注手術(shù)的大鼠，其海馬CA1區(qū)的正常神經(jīng)元數(shù)目明顯少于正常組大鼠，術(shù)后4 w的正常神經(jīng)元數(shù)目最少。Black〔13〕研究認(rèn)為與學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系密切的海馬神經(jīng)元對反復(fù)腦缺血再灌注損傷的敏感性最高，本研究結(jié)果與該報(bào)道相一致。在這一病理改變的影響下，正常組和模型組的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異顯著。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中模型組的逃避潛伏期明顯高于正常組，通過原平臺(tái)次數(shù)、原平臺(tái)所在象限停留百分比明顯低于正常組。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中模型組的反應(yīng)時(shí)間、學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)、記憶錯(cuò)誤次數(shù)明顯高于正常組，潛伏時(shí)間明顯低于正常組。范鳴玥〔14〕通過線栓法再灌注大腦建立血管性癡呆大鼠模型行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯差于正常組。Endo等〔15〕研究顯示，對缺血敏感的海馬CA1區(qū)總GSK-3β的表達(dá)未發(fā)生變化，而p-GSK-3β的表達(dá)增加。本研究與上述研究結(jié)果一致，提示對于VD大鼠，Akt-GSK3β細(xì)胞信號(hào)通路可調(diào)控細(xì)胞凋亡，在保護(hù)神經(jīng)元和改善認(rèn)知的過程中發(fā)揮重要作用。

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〔2014-06-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)