一種新型肽對Lewis腫瘤細胞凋亡的影響

孫洋劉爽徐靜1王慧1周慶偉2

(吉林大學藥學院，吉林長春130021)

摘要〔〕目的探討新型肽對Lewis腫瘤細胞凋亡作用的影響。方法采用吖橙啶/溴乙啶(AO/EB)及線粒體膜電位法檢測Lewis腫瘤細胞在48 h細胞凋亡情況，熒光顯微鏡觀察AO/EB雙染法檢測細胞凋亡及線粒體膜電位的變化。結(jié)果新型肽對Lewis細胞具有明顯促進凋亡的作用。熒光顯微鏡下觀察：新型肽(2 000 μg/ml)治療組可見典型的細胞凋亡形態(tài)學特征性改變；線粒體膜電位顯著降低；細胞凋亡率明顯增加分別與空白對照及新型肽(1 000 μl/ml)治療組比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。結(jié)論新型肽可能通過降低Lewis腫瘤細胞線粒體膜電位，誘導細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤生長作用。

關(guān)鍵詞〔〕新型肽；Lewis腫瘤細胞；細胞凋亡；線粒體膜電位

中圖分類號〔〕R73〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：周慶偉(1959-)，男，教授，主要從事藥理學研究。

1長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院2吉林大學再生醫(yī)學科學研究所

第一作者：孫洋(1990-)，女，在讀碩士，主要從事生物藥學研究。

目前肺癌的發(fā)病機制尚未十分清楚，研究顯示，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞凋亡密切相關(guān)〔1～3〕。其傳統(tǒng)的治療原則是術(shù)后先放療后化療，或單獨放療/化療，但都難以提高其臨床療效〔4〕，其治愈率仍較低。目前國內(nèi)外已研究的抗腫瘤藥物眾多，但多數(shù)價格昂貴且不良反應大。同時也存在耐藥性問題，使其臨床應用受到一定限制〔5～7〕。為此，尋找高效、低毒、價廉的新的治療藥物已成為近年來研究的熱點。本實驗旨在研究一種新型肽對Lewis腫瘤細胞凋亡作用的影響，并通過檢測Lewis細胞凋亡及線粒體膜電位等變化，初步探討其抑制作用的可能機制，為進一步研究新型肽在臨床上治療肺腫瘤提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1細胞、主要試劑及藥品 Lewis細胞株：購自中國科學院上海細胞生物學研究所。主要試劑：(1)線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1，產(chǎn)品編號：C2006)；(2)吖橙啶( 中國北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司 批號：1AB10220)；(3) 新型肽為本研究室設計，由中國 上海吉爾公司合成，純度為98%；(4)博來霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：2131001)；(5)標準胎牛血清(天津灝洋生物制品科技有限責任公司，批號：TBD31HB)。

1.2主要儀器(1)熒光顯微鏡 NiKon ECLIPSE 80i (日本尼康公司)；(2)二氧化碳培養(yǎng)箱 ( 日本 三樣電機株式會社制造 產(chǎn)品型號：NCO-15AC)；(3) AN YANG 超凈臺 (中國 蘇州安洋科技發(fā)展有限公司 型號：BSC-BOOⅡB2)。

1.3方法

1.3.1吖橙啶/溴乙啶(AO/EB)雙染細胞爬片取對數(shù)生長期Lewis腫瘤細胞，0.25%胰酶消化計數(shù)。調(diào)整細胞懸液3×105Cells/ml接種6孔板中，1 ml/孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)4 h，細胞貼壁； 隨機分為空白對照組、博來霉素組及不同濃度新型肽(1 000、1 500及2 000 μg/ml)組，每組設2個復孔，50 μl/孔，每孔終體積2 ml。置入37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h；③ 取出爬滿細胞的蓋玻片置于載玻片上，在蓋玻片上滴加AO和EB染液各5 μl。立即在熒光顯微鏡下觀察、拍照。每個視野計數(shù)所含的程序性死亡細胞數(shù)，取其均數(shù)計算細胞程序性凋亡率。

1.3.2JC-1染色檢測線粒體膜電位 取對數(shù)生長期Lewis腫瘤細胞，常規(guī)消化后制成單細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)為3.0×105/ml，接種在6孔板，1 ml/孔。置入37℃，5% CO2孵育4 h，細胞貼壁；隨機分為CCCP陽性對照組、空白對照組、博來霉素(100 μg/ml)組及不同的濃度新型肽(1 000、1 500及2 000 μg/ml)組，50 μl/孔，每組設2個復孔，每孔終體積2 ml。置入37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。CCCP組(作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照)，每孔加入CCCP(CCCP按照1∶1 000的比例加入到細胞培養(yǎng)液中) 。博來霉素組與不同濃度的新型肽組每孔加入0.5 ml JC-1染色工作液。37℃孵育20 min后，棄掉上清液，用冰浴JC-1(1X)緩沖液沖洗細胞2次后，每孔加入1 ml培養(yǎng)液。熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長530 nm。拍照。

1.4統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1AO/EB雙染熒光染色對細胞凋亡形態(tài)觀察新型肽作用于Lewis腫瘤細胞48 h，采用AO/EB染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，空白對照組可見大量被染成的綠色細胞，細胞呈梭形，胞核完整，界限清楚。隨著藥物濃度的增加，正常細胞數(shù)目逐漸減少，凋亡細胞數(shù)目顯著增多，其細胞核和(或)細胞質(zhì)發(fā)出紅色熒光。新型肽(2 000 μg/ml)組細胞凋亡率〔(20.24±0.34)%〕分別與空白對照組〔(5.44±0.99)%〕及新型肽(1 000 μg/ml)組〔(10.66±0.32)%〕比較具有顯著性差異(P<0.05)；新型肽(2 000 μg/ml)組與博來霉素組〔(20.38±0.19)%〕比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)另外新型肽(1 500 μg/ml)凋亡率為〔(15.20±0.22)%〕，見圖1。

2.2新型肽對Lewis腫瘤細胞線粒體膜電位的影響熒光顯微鏡下可見，CCCP陽性對照組，經(jīng)10 μmol/L濃度處理20 min后C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞線粒體的膜電位完全喪失JC-1染色后呈綠色熒光。空白對照組，大多數(shù)細胞染色呈紅色熒光。新型肽(2 000 μg/ml)組作用于Lewis腫瘤細胞48 h：多數(shù)細胞呈綠色熒光，細胞呈梭形，提示細胞發(fā)生凋亡；紅色熒光的細胞呈園形，但突起較正常對照組和新型肽(1 000 μg/ml)組及新型腫瘤抑素(1 500 μg/ml)組的紅色熒光細胞呈圓形。各實驗組細胞線粒體膜電位均有不同程度下降，新型肽(2 000 μg/ml)組〔(28.18±0.19)%〕分別與空白對照組〔(11.06±0.37)%〕及新型肽(1 000 μg/ml)組〔(16.10±0.16)%〕比較具有顯著差異(P<0.05)，新型肽(2 000 μg/ml)組與博來霉素組〔(28.12±0.24)%〕比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，CCCP組為100%,新型肽(1 500 μg/ml)為〔(22.14±0.21)%〕。見圖2。

圖1　新型肽對Lewis腫瘤細胞48 h凋亡的作用(×20)

圖2　新型肽對Lewis腫瘤細胞線粒體膜電位的影響(×20)

3討論

惡性腫瘤由基因變異所導致并呈無限增殖、凋亡機制紊亂等特點，已經(jīng)成為全世界最主要的死亡原因之一。鑒于傳統(tǒng)抗腫瘤藥物往往選擇性差、毒副作用大，其治愈率仍較低。對其治療至今尚無突破性進展。為此，尋找高效、低毒、療效穩(wěn)定的抗腫瘤藥物是目前研究開發(fā)的重點，而新型的多肽藥物恰恰具備了這些優(yōu)點。腫瘤的發(fā)生是多途徑、多步驟的，還與細胞凋亡有關(guān)，細胞增殖與凋亡之間的平衡失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，抑制腫瘤細胞增殖，誘導其凋亡已成為腫瘤治療的重要手段之一〔8～11〕。本實驗結(jié)果說明隨著藥物濃度的增加，凋亡細胞比例逐漸增加。

JC-1是廣泛用于檢測線粒體膜電位的一種理想光探針。在線粒體膜電位較高時，JC-1集聚在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能集聚在線粒體基質(zhì)中，此時成為單體狀態(tài)，產(chǎn)生綠色熒光。這樣通過光顏色就可以非常方便地檢測線粒體膜電位的變化。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件〔12，13〕。本研究表明新型肽可能直接作用于Lewis細胞線粒體，使線粒體膜通透性增加，線粒體跨膜電位下降，從而誘導細胞凋亡的發(fā)生。

綜上，新型肽可使線粒體膜電位下降，誘導Lewis腫瘤細胞凋亡，其誘導凋亡的分子機制可能與線粒體膜電位下降有關(guān)。

4參考文獻

1陳果，王雄彪.植物多酚類中藥單體治療哮喘研究進展〔J〕.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2012;14(3)：63-5.

2Sancho-Martinez I，Martin-Villalba A.Tyrosine phosphorylation and CD95：a FAS cinating switch〔J〕.Cell Cycle，2009;8(6)：838-42.

3Eisele G，Roth P，Hasenbach K，etal.APO010，a synthetic hexameric CD95 ligand，induces human glioma cell death in vitro and in vivo〔J〕.Neuro Oncol，2011;13(2)：155-64.

4Konkankit VV，Kim W，Koya RC，etal.Decitabine immunosensitizes human gliomas to NY-ESO-1 specific T lymphocyte targeting through the Fas/Fas ligand pathway〔J〕.J Transl Med，2011;9：192.

5Zhao JX，Liu XQ，Dong BJ.Primary study of bevacizumab combined with temozolomide for recurrent glioma〔J〕.Chin Clin Oncol,2011;16(10)：920-2.

6Okada M，Sato A，Shibuya K.JNK contributes to temozolomide resistance of stem-like glioblastoma cells via regulation of MGMT expression〔J〕.Int J Oncol，2014;44(2)：591-9.

7Sze CI，Su WP，Chiang MF，etal.Assessing current therapeutic approaches to decode potential resistance mechanisms in glioblastomas〔J〕.Front Oncol，2013;3：59.

8方艷秋，齊亞靈，白曉，等.Survivin反義核苷酸對肝細胞株SMMC-7721增殖的影響〔J〕.吉林大學學報(醫(yī)學版)，2013;39(2)：278-81.

9Cobbs CS.Cytomegalovirus and brain tumor：epidemiology，biology and therapeutic aspects〔J〕.Curr Opin Oncol，2013;25(6):682-8.

10Dubrez L，Berthelet J，Glorian V.IAP proteins as targets for drug development in oncology〔J〕.Onco Targets Ther，2013;9：1285-304.

11Bartuzi P，Hofker MH，van de Sluis B.Tuning NF-κB activity：a touch of COMMDD proteins〔J〕.Biochim Biophys Acta，2013;1832(12)：2315-21.

12Stuckey DW，Shan K.TRAIL on trail：preclinical advances in cancer therapy〔J〕.Trends Mol Med，2013;26(13)：154-8.

13Fink MY，Chipuk JE.Survival of HER2-positive breast cancer cells：receptor signaling to apoptotic control center〔J〕.Genes Cancer，2013;4(5/6)：187-95.

〔2015-04-25修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)