非小細胞肺癌組織miR-34a的表達及其對H1299細胞增殖的影響

嚴程陳曉品1周憲張素潔劉洋劉玉向廷秀2

(重慶醫(yī)科大學腫瘤科，重慶400016)

摘要〔〕目的觀察非小細胞肺癌(NSCLC)組織中miR-34a的表達情況及其對NSCLC細胞系H1299增殖的影響。方法RT-PCR方法檢測miR-34a在NSCLC組織和NSCLC細胞系H1299中的表達情況。克隆形成實驗及MTT增殖實驗檢測miR-34a對NSCLC 細胞系H1299增殖能力的影響；生物信息學方法預測miR-34a可能的功能性靶基因，并采用熒光素酶報告基因實驗驗證預測的功能性靶基因。Western印跡檢測miR-34a對預測靶基因表達的影響。結果相比正常組織而言，NSCLC組織和細胞系H1299中miR-34a表達均顯著下降(P<0.05)；轉染miR-34a可顯著抑制NSCLC 細胞系H1299的增殖能力(P<0.05)，而轉染miR-34a 抑制劑可增加NSCLC 細胞系H1299的增殖能力(P<0.05)。生物信息學預測顯示Notch1是miR-34a可能的功能性靶基因，且得到熒光素報告實驗結果證實。Western印跡結果顯示轉染miR-34a 可顯著抑制NSCLC 細胞系H1299中Notch1的表達。結論miR-34a 可通過調節(jié)Notch1的表達，進而抑制NSCLC 細胞的增殖。

關鍵詞〔〕非小細胞肺癌；miR-34a；增殖；Notch1

中圖分類號〔〕R736〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：陳曉品(1954-)，男，教授，博士，主要從事惡性腫瘤放射治療研究。

1重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科

2重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗研究中心

第一作者：嚴程(1980-)，男，碩士，主要從事腫瘤精確放療研究。

非小細胞肺癌(NSCLC)的發(fā)生與多種微小RNA(miR)表達異常有關〔1〕。miR可在轉錄后水平對基因的表達進行負調控〔2〕，參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并在腫瘤細胞的轉移和侵襲中具有重要作用〔3〕。miR-34a已證實與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。在結直腸癌中，miR-34a可通過調節(jié)DNA甲基化而參與結直腸癌發(fā)生和發(fā)展〔4〕。在胃癌中，miR-34a可通過調節(jié)PI3K信號通路，進而抑制上皮生長因子受體(EGFR)信號，從而發(fā)揮胃癌抑制作用〔5〕。同時，miR-34a還證實與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展密切相關〔6〕。然而，由于miR-34a下游靶基因眾多，因此miR-34a調節(jié)NSCLC發(fā)生發(fā)展的機制還有待深入的研究。

1材料與方法

1.1臨床資料收集2012年9月至2014年1月于我院進行NSCLC手術的NSCLC標本35例，標本取自原發(fā)腫瘤組織，同時收集上(下)切緣正常組織作為對照，正常組織均于術后病理證實無NSCLC組織侵犯。獲取標本后迅速置于液氮中保存。所有患者術前均未接受化療和放療?；颊吣挲g55～72〔平均(61.64±8.15)〕歲。

綜上所述，NSCLC組織和NSCLC細胞系H1299中miR-34a的表達量顯著降低，且 miR-34a可通過調節(jié)Notch1的表達而抑制NSCLC細胞系H1299的增殖，為miR-34a調節(jié)NSCLC進展機制提供了一種新的見解。

1.4噻唑藍(MTT)增殖檢測轉染miR-34a、NC、anti-miR-NC和anti-miR-34a的H1299細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔中加入20 μl的MTT溶液，孵箱中放置4 h后吸出上清至ELISA板中，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，低速震蕩10 min后，波長490 nm 處測定OD值。

1.3RT-PCRTrizol法提取NSCLC組織標本和H1299細胞總RNA，反轉錄成cDNA。PCR反應條件：95℃ 5 min，95℃10 s，60℃ 20 s，共40個循環(huán)。引物序列：miR-34a上游引物：5’-CCCACATTTCCTTCTTATCAACAG-3’，下游引物：5’-GGCATCTCTCGCTTCATCTT-3’；內參照U6上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。得到的數(shù)據(jù)通過比較CT值法(2-△△Ct)進行定量分析。

1.2NSCLC細胞系H1299細胞購自上海拜力生物科技有限公司。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(BSA)的高糖DMEM培養(yǎng)基中。

1.5克隆形成實驗轉染miR-34a、NC、anti-miR-NC和anti-miR-34a的A549細胞各5×103接種于6孔板中，培養(yǎng)72 h后，形成的克隆用甲醇固定，并用含0.1%結晶紫的20%甲醇染色30 min，計數(shù)形成的克隆數(shù)。

例如，在探索孟德爾分離定律過程中，教師已經(jīng)具有“減數(shù)分裂和受精作用”的知識，但學生還不具備。這種認知結構的差異性，往往會使教師對分離定律的講解高于學生的最近發(fā)展區(qū)，導致學生由于難以理解而一字不漏地記下孟德爾分離定律的假設。這時，一方面需要教師將認知結構還原至學生的水平(沒有減數(shù)分裂的知識)，另一方面需要介紹孟德爾提出分離定律的時代背景(知識探索的開始)。將這兩個方面作為教學起點，從學生的角度，引領學生一起探索孟德爾分離定律的發(fā)生與發(fā)展。

1.9統(tǒng)計學方法應用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行分析，多組數(shù)據(jù)間比較采用Anova分析方法，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗。

建筑空間是一個整體的系統(tǒng)，建筑空間形式可以直接反映氣候適應性策略。由于不同的空間環(huán)境和不同的建筑群體，建筑在物理方面將反映不同的氣候適應性和空間價值，這在建筑空間設計中具有特別重要的研究意義。譬如，對于炎熱潮濕地區(qū)的建筑設計，最重要的是強調空氣對流能夠使熱濕空氣相互流動，使人們感到舒適。除了要注意局部通風，還應注意空間的熱防護問題，通過對空間內部環(huán)境的合理運用可以有效地將外界環(huán)境中的氣流導入室內，從而有效解決通風防熱問題。

1.7細胞總蛋白提取實驗用細胞以冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次，400 r/min離心，5 min；棄去上清，細胞沉淀中加入蛋白酶抑制劑和適量的CytoBuster蛋白提取試劑，高速渦旋細胞裂解混合物25 s，室溫放置15 min；4℃，12 000 r/min離心15 min；所得上清部分即細胞總蛋白，除留部分樣品檢測蛋白濃度外，其余分裝15 μl/管，-80℃ 凍存。

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1.8Western印跡等量的提取蛋白經(jīng)8%～10%十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離膠和5%濃縮膠分離后，半干轉印至硝酸纖維素膜上，以含5% BSA的Tris鹽酸緩沖液(TBST)室溫封閉1 h，加入一抗4℃過夜孵育。第2天用0.1% TBST 洗膜3次，5 min/d，加入相應的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育1 h。0.1% TBST 洗膜后，硝酸纖維素膜以Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化學發(fā)光底物對條帶進行顯色。Actin作為內參對照。所有實驗至少重復3次。

1.6靶基因預測及驗證〔7〕通過TargetScans靶基因預測軟件篩選出Notch1作為miR-34a的靶基因。采用熒光素酶報告方法驗證靶基因。

2結果

3Lin Y，Wu J，Chen H，etal.Cyclin-dependent kinase 4 is a novel target in micoRNA-195-mediated cell cycle arrest in bladder cancer cells〔J〕.FEBS Lett，2012;586(4)：442-7.

2.2miR-34a對H1299細胞增殖的影響轉染miR-34a可顯著抑制H1299細胞的克隆形成能力(P<0.05)。而轉染anti-miR-34a可顯著增加H1299細胞的克隆形成能力(P<0.05)；此外，MTT增殖實驗結果顯示，轉染miR-34a可顯著抑制H1299細胞的增殖能力(P<0.05)，而轉染anti-miR-34a可顯著增加H1299細胞的增殖能力(P<0.05)。見圖1，表1。

2.3miR-34a靶基因預測及驗證TargetScans靶基因預測軟件提示Notch1可能是miR-34a的靶基因，且為感興趣的基因。miR-34a預測結合的Notch1 3’-UTR靶位點見圖2。熒光素酶報告實驗證實miR-34a與Notch1間存在直接的相互作用。

表1　miR-34a對H1299細胞增殖的影響

與NC組比較：1)P<0.05；與anti-miR-NC組比較：2)P<0.05

圖1　miR-34a對H1299細胞增殖能力的影響

圖2　TargetScans靶基因預測軟件預測miR-34a靶基因

2.4miR-34a與Notch1表達相關性轉染miR-34a可顯著抑制H1299細胞中Notch1的表達(P<0.05)，而轉染anti-miR-34a可顯著增加H1299細胞中Notch1的表達(P<0.05)。見圖3。

圖3　Western印跡檢測Notch1表達

3討論

肺癌是惡性腫瘤中致死率最高的一種疾病，其中NSCLC的5年生存率僅為16%，且80%的肺癌均為NSCLC〔8〕。NSCLC的發(fā)生不僅與p53、Rb和Ras等蛋白質基因編碼異常有關〔9〕，還與多種miR表達異常有關〔1〕。miRNA最早于1993 年由Lee 等在線蟲體內發(fā)現(xiàn)，是一類約22 nt大小的非編碼單鏈RNA分子。miRNA在許多生物過程，包括發(fā)育、分化、凋亡、代謝、免疫和腫瘤進展中均具有重要的作用。本研究進一步證實miR-34a與H1299細胞的增殖能力密切相關。提示miR-34a具有抑制NSCLC發(fā)生和發(fā)展的作用。該結果與文獻報道結果一致〔6〕。

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每個miRNA可以調控多個靶基因，而每個基因的mRNA又可以受到多個miRNA的調節(jié)。miRNAs的功能主要由下游靶基因的生物學效應決定。本實驗通過TargetScans靶基因預測軟件篩選出miR-34a的靶基因，在眾多靶基因中，因Notch1在人類癌癥的進展中具有重要的作用，而成為感興趣的靶基因。已知哺乳動物中表達有4種Notch受體及5種相關配體(Jagged-1，2，Delta-1，3，4)〔10〕。人類癌癥中多存在Notch信號傳導失調，同時，很多的研究表明Notch信號傳導與癌癥血管生成和轉移密切相關〔11〕。對于結直腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，Notch1的表達存在明顯的升高，且與結直腸癌的增殖、分化和轉移密切相關〔12〕。本研究提示，Notch1為miR-34a的功能性靶基因。

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4參考文獻

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2.1miR-34a在NSCLC組織和細胞系的表達較正常組織(1.02±0.16)相比，miR-34a在NSCLC組織的表達量(0.25±0.09)顯著降低(P<0.05)；且miR-34a在NSCLC細胞系H1299中的表達量(0.33±0.14)亦顯著降低(P<0.05)。

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上述內容提到了智能真空開關裝置，臨時供電模式的相關工作人員需要不斷學習，了解新技術和新技能，掌握最有效、最實用的臨時供電模式，了解其運作原理和特點。

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4.應有落地問題上的挑戰(zhàn)。工信部信息中心此前發(fā)布的《2018年中國區(qū)塊鏈產(chǎn)業(yè)白皮書》顯示，截至2018年3月底，我國以區(qū)塊鏈為主營業(yè)務的區(qū)塊鏈公司數(shù)量已超過450家，中國區(qū)塊鏈產(chǎn)業(yè)初步形成規(guī)模。但這其中大部分的項目無法落地。

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〔2015-03-25修回〕

(編輯袁左鳴)