Orexin-A對癲癇大鼠學習記憶能力及海馬齒狀回神經細胞增殖的影響

孫杰李籌忠王曲高方友

(貴州省人民醫(yī)院神經外科，貴州貴陽550002)

摘要〔〕目的探討Orexin-A(OXA)對癲癇大鼠學習記憶能力及海馬齒狀回神經細胞增殖的影響。方法選取健康成年SD大鼠50只，隨機分為對照組、PTZ+NS組、PTZ+OXA組、PTZ+U0126組、PTZ+U0126+OXA組，每組10只。選用PTZ(30 mg/kg)腹腔注射造模。對照組和PTZ+NS組注射8 μl生理鹽水，PTZ+OXA組注射等量1.5 nmol/μl的OXA，PTZ+U0126組注射等量的U0126，PTZ+U0126+OXA組分別注射等量U0126和OXA；注射后恢復飼養(yǎng)7 d后進行水迷宮試驗。觀察各組大鼠學習記憶能力，并采用免疫熒光染色法檢測海馬齒狀回神經細胞增殖情況。結果與對照組相比，其余四組大鼠的逃避潛伏期明顯變長(P<0.01)。PTZ+U0126組逃避潛伏期明顯長于PTZ+NS組(P<0.01)；PTZ+NS組、PTZ+U0126組、PTZ+U0126+OXA組逃避潛伏期明顯長于PTZ+OXA組(P<0.05)。與對照組相比，其余四組大鼠穿越平臺的次數、穿越平臺所處象限的時間均明顯減少(P<0.01)；PTZ+OXA組、PTZ+U0126+OXA組大鼠穿越平臺象限的次數、穿越平臺所處象限的時間均明顯多于PTZ+NS組(P<0.01)。PTZ+U0126+OXA組大鼠穿越平臺象限的次數、穿越平臺所處象限的時間明顯少于PTZ+OXA組(P<0.01)。PTZ+U0126組海馬齒狀回區(qū)Brdu+/ DCX+細胞數明顯低于PTZ+NS組(P<0.01)；PTZ+NS組、PTZ+U0126組、PTZ+U0126+OXA組海馬齒狀回區(qū)Brdu+/DCX+細胞數明顯低于PTZ+OXA組(P<0.05)。結論OXA能夠通過促進齒狀回顆粒細胞的再生改善癲癇大鼠的學習記憶能力，其可能與ERK1/2激活有關。

關鍵詞〔〕癲癇；Orexin-A；學習記憶；神經細胞

中圖分類號〔〕R749〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：高方友(1972-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事癲癇的發(fā)病機制研究。

第一作者：孫杰(1988-)，男，碩士，主要從事癲癇的發(fā)病機制研究。

長期癲癇發(fā)作會降低學習記憶能力，對患者的日常生活造成嚴重影響。目前認為，癲癇主要通過破壞神經元、打破神經肽與神經遞質間的平衡等多種機制損傷學習記憶能力〔1〕。Orexins為一種興奮性神經肽，對神經內分泌、體內能量代謝、進食等多方面發(fā)揮關鍵的調控作用。近年來研究顯示，Orexin-A(OXA)能夠激活細胞外信號調節(jié)激酶(ERK1/2)參與細胞生長和增殖〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)OXA能夠提高癲癇大鼠的學習記憶能力，但該作用是否通過激活ERK1/2來實現(xiàn)至今仍不明確〔3〕。本次研究探討OXA對癲癇大鼠學習記憶能力、均馬齒狀回神經細胞增殖的影響。

1材料與方法

1.1動物與分組選取健康成年SD大鼠50只，清潔級，體重150～180 g，吉林大學實驗動物中心提供，合格證：SCXX-(吉)2003-0004。隨機分為對照組、成四唑(PTZ)聯(lián)合生理鹽水(PTZ+NS)組、PTZ+OXA組、ER1/2抑制劑組(PTZ+U0126)組、PTZ+U0126+OXA組，每組10只。24℃溫度下分籠喂養(yǎng)。

1.2部分儀器與試劑OXA(上海玉博生物科技有限公司)；U0126(上海拜力生物科技有限公司)；PTZ、嗅脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)抗體(圣克魯斯生物技術公司)；小鼠抗大鼠BrdU單克隆抗體、山羊抗大鼠雙腎上腺皮質激素(DCX)多克隆抗體(上海研晶生化試劑有限公司)；兔抗山羊IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司)。泰盟Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)WMT-100(成都泰盟軟件有限公司)。腦立體定位儀、微量注射器(北京銘泰佳信科技有限公司)。

1.3大鼠癲癇模型建立除對照組外的四組大鼠每日清晨8時給予PTZ(30 mg/kg)腹腔注射，觀察0.5～1 h，聯(lián)系30 d，到符合造模成功標準時為止。對照組大鼠同時間注射等量生理鹽水。大鼠癲癇癥狀的判斷依據Racine分級標準：Ⅰ級：出現(xiàn)立須等面部抽搐；Ⅱ級：頸部肌肉痙攣，主要表現(xiàn)為點頭；Ⅲ級：單側前肢抽搐；Ⅳ級：雙側前肢抽搐，同時伴身體直立；Ⅴ級：雙側后肢強直，用時伴全身陣攣。連續(xù)出現(xiàn)Ⅳ級及以上≥3次為造模成功。

1.4藥物側腦室注射用10%的水合氯醛(300 mg/kg)麻醉造模成功后的大鼠，固定在腦立體定位儀上，將不銹鋼微導管插入后固定。對照組和PTZ+NS組注射8 μl生理鹽水，PTZ+OXA組注射等量1.5 nmol/μl的OXA，PTZ+U0126組注射等量U0126，PTZ+U0126+OXA組分別注射等量OXA、U0126。注射后恢復飼養(yǎng)7 d后進行水迷宮試驗。

1.5Morris水迷宮試驗(1)定位航行試驗：首日將大鼠放入水池中自由游泳3 min，熟悉池中環(huán)境；第2天起，分別于每日上午、下午分別測試1次，每次測試均讓大鼠從四個象限中各入水1次，記錄尋找平臺的線路圖，爬上平臺所用時間為逃避潛伏期和游泳速度。若在2 min內仍未尋找到平臺，則將其放在平臺上休息30 min，記錄潛伏期為2 min，訓練時間間隔1 min。(2)空間搜索試驗：完成定位航行試驗后第2天將水池中的平臺拿去，從同一個象限將大鼠放入水池中，記錄2 min內經過平臺所在位置的次數和在平臺所在象限的游泳時間。

1.6海馬齒狀回Brdu和DCX表達檢測采用免疫熒光染色法，用Brdu和DCX進行熒光雙標記，對新生細胞的增殖、遷移進行檢測。各組大鼠在Morris水迷宮試驗結束后12、24 h分別腹腔注射BrdU，劑量為100 mg/kg。7 d后麻醉大鼠，先用200 ml生理鹽水快速灌注，再用4%多聚甲醛溶液250 ml先快后慢灌注30 min，取腦組織并制作成20 μm的海馬連續(xù)冠狀切片。修復抗原30 min后，用2 mol/L的鹽酸在常溫條件下孵育30 min后用2 mol/L的硼酸溶液相同條件下孵育30 min，行DNA變性；磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底洗凈后，加入小牛血清封閉液孵育60 min，將封閉液棄去后加入DCX多克隆抗體(1∶100)在4℃環(huán)境中放置過夜；PBS徹底洗凈后加入相應的熒光二抗，孵育60 min；PBS徹底洗凈后封片。觀察Brdu和DCX的熒光表達。

1.7統(tǒng)計學方法應用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1行為學觀察注射PTZ第3～5天后，TZ+NS組、PTZ+OXA組、PTZ+U0126組、PTZ+U0126+OXA組大鼠均表現(xiàn)面部抽搐。第5～7天出現(xiàn)頸部肌肉抽搐；8～17 d，多數大鼠癲癇發(fā)作達Ⅲ級，出現(xiàn)單側前肢抽搐；17～25 d，癲癇發(fā)作達Ⅳ～Ⅴ級，出現(xiàn)雙側前肢抽搐，并伴身體直立。30 d時，90.00%大鼠造模成功。其中3只大鼠死亡，4只大鼠未達造模成功標準而剔除。最終TZ+NS組8只、PTZ+OXA組9只、PTZ+U0126組8只、PTZ+U0126+OXA組8只。

2.2水迷宮試驗結果

2.2.1定位航行試驗隨訓練時間延長，各組大鼠的平均逃避潛伏期均縮短。與對照組相比，其余四組大鼠的逃避潛伏期明顯變長(P<0.01)，PTZ+U0126組逃避潛伏期明顯長于PTZ+NS組(P<0.01)；PTZ+NS組、PTZ+U0126組、PTZ+U0126+OXA組逃避潛伏期明顯長于Frz+OXA組(P<0.05 ，P<0.01)。見表1。

表1　各組定位航行試驗潛伏期比較 ± s)

2.2.2空間搜索試驗對照組中大鼠游泳軌跡清晰，部分接近直線，目的性強；PTZ+Ns組大鼠游泳軌跡混亂，無目的性；PTZ+OXA組大鼠游泳軌跡清晰；PTZ+U0126組大鼠游泳軌跡雜亂；PTZ+U0126+OXA組大鼠游泳軌跡較為清晰。與對照組相比，其余四組大鼠穿越平臺的次數、穿越平臺所處象限的時間均明顯減少(P<0.01)；PTZ+OXA組、PTZ+U0126+OXA組大鼠穿越平臺象限的次數、穿越平臺所處象限的時間均明顯多于PTZ+NS組(P<0.01)；但PTZ+U0126組大鼠穿越平臺象限的次數及所在象限的時間均明顯減少。PTZ+U0126+OXA組大鼠穿越平臺象限的次數及所在象限的時間明顯少于PTZ+OXA組(P<0.01)。見表2。

表2　各組空間搜索試驗穿越平臺次數和象限的

2.3各組大鼠海馬齒狀回DCX和Brdu表達情況比較各組大鼠均有DCX表達，多集中在齒狀回顆粒下區(qū)，少數在門區(qū)。Brdu表達多集中在齒狀回顆粒下區(qū)。多數Brdu+細胞有DCX+表達，Brdu+/ DCX+表達多集中于齒狀回顆粒下區(qū)，見圖1～圖3。海馬齒狀回區(qū)Brdu+/DCX+細胞數在PTZ+NS組和對照組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。PTZ+U0126組海馬齒狀回區(qū)Brdu+/ DCX+細胞數明顯低于PTZ+NS組(P<0.01)；與PTZ+OXA組相比，PTZ+NS組、PTZ+U0126組、PTZ+U0126+OXA組海馬齒狀回區(qū)Brdu+/DCX+細胞數明顯減少(P<0.05，P<0.01)。

A為對照組；B為PTz+NS組；C為PTZ+OXA組；D為PTZ+U0126組；E為PTZ+U0126+OXA組(下圖同) 圖1　大鼠海馬齒狀回DCX+細胞表達(×400)

圖2　大鼠海馬齒狀回Brdu+細胞表達(×400)

圖3　大鼠海馬齒狀回Brdu+/ DCX+細胞表達(×400)

3討論

臨床對癲癇的治療不應只停留在對病情的有效控制，通過改善認知功能，提升患者的生活質量已成為癲癇治療的最終目的〔4〕。癲癇病情發(fā)展損傷海馬神經、突觸等相關結構，腦中神經遞質失衡、電生理紊亂等多種原因共同引起了癲癇患者學習記憶能力障礙。癲癇反復發(fā)作會降低CSF、OXA水平，也是引起記憶能力障礙的可能原因之一〔5〕。本研究說明OXA能明顯縮短PTZ導致的癲癇大鼠逃避潛伏期。研究認為，重度癲癇會對海馬細胞遷移、增殖能力造成嚴重影響，引起非正常的神經元環(huán)路，損傷學習記憶能力〔6〕。本次研究中，PTZ+OXA組齒狀回顆粒下層多見增殖的Brdu+細胞，樹突向分子層伸展與CA3區(qū)域的神經元相連，共同構建起局部突觸聯(lián)系，促進長時程增強效應(LTP)的生成，說明OXA可有效提高記憶再現(xiàn)能力。

中樞神經系統(tǒng)中，ERK1/2廣泛表達可協(xié)調神經元對外界刺激信號及時作出反應，改善學習記憶能力〔7〕。本次研究說明ERK1/2的激活不但會緩解癲癇大鼠空間學習記憶能力減退，還會降低OXA水平，使癲癇大鼠的學習記憶能力得到改善，提示OXA參與學習記憶的過程與激活ERK1/2密切相關。

相關研究認為，癲癇病情發(fā)作可引發(fā)ERK1/2的過度激活，加重癲癇對腦組織的損傷；但ERK1/2在病情發(fā)作后存在一過性激活，可作為一種保護性代償反應〔8〕。本次研究中，ERK1/2抑制劑能夠使癲癇對海馬CA3區(qū)域神經細胞的損傷加重，對OXA促進新生顆粒細胞遷移至顆粒層起明顯抑制作用?？梢奜XA激活ERK1/2可能通過抑制海馬區(qū)細胞凋亡、調節(jié)神經突觸可塑性形成、促進齒狀回顆粒細胞的增殖，改善學習記憶能力。

綜上所述，OXA可有效提升癲癇大鼠的學習記憶能力，可能與激活ERK1/2、促進海馬齒狀回神經細胞增殖相關。但如何防止過度激活ERK1/2，誘導海馬齒狀回神經細胞再生，將新生的神經元加入進神經環(huán)路中仍需要進一步研究。

4參考文獻

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〔2015-03-19修回〕

(編輯袁左鳴)