黃芪甲苷灌胃預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

馬小亮王桂敏1

(遼寧醫(yī)學(xué)院研究生院，遼寧錦州121001)

摘要〔〕目的探討黃芪甲苷灌胃預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷(I/R)的保護作用。方法將100只大鼠隨機分為三組，最終90只大鼠造模成功，其中假手術(shù)組29只，模型組30只，干預(yù)組31只。假手術(shù)組與模型組給予普通飼養(yǎng)+生理鹽水(2 ml·kg-1·d-1)灌胃，干預(yù)組給予普通飼養(yǎng)+黃芪甲苷(10 mg·kg-1·d-1)灌胃。造模時，假手術(shù)組大鼠只在冠狀動脈左室支左心耳下緣約0.5 cm處穿線，不結(jié)扎；模型組及干預(yù)組大鼠給予結(jié)扎。于灌注24 h后采用TUNEL法計算細胞凋亡指數(shù)(AI)，比較Bax、Bcl-2以及半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3蛋白的表達。結(jié)果三組間AI、Bax、Bcl-2以及caspase-3蛋白比較差異表達(均P<0.05)，進一步兩兩比較，模型組及干預(yù)組的AI、Bax、Bcl-2以及caspase-3蛋白的表達顯著高于假手術(shù)組，模型組的AI、Bax、caspase-3蛋白表達顯著高于干預(yù)組，Bcl-2蛋白表達顯著低于干預(yù)組(均P<0.05)。結(jié)論在大鼠心肌缺血再灌注過程中存在明顯的細胞凋亡過程，在此過程中，黃芪甲苷可能通過上調(diào)Bcl-2的表達、降低Bax的表達實現(xiàn)其對心肌細胞的保護作用。

關(guān)鍵詞〔〕心肌缺血；再灌注損傷

中圖分類號〔〕R54〔文獻標(biāo)識碼〕A〔

通訊作者：王桂敏(1957-)，女，碩士，主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療心腦血管及老年病方面的研究。

1遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科

第一作者：馬小亮(1984-)，男，碩士，醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療心腦血管及老年病方面的研究。

在心肌缺血的心肌細胞中，即使重新恢復(fù)血流供應(yīng)，也可能會發(fā)生心肌細胞超微結(jié)構(gòu)、代謝功能以及電生理方面的損害，這種損害甚至是無法逆轉(zhuǎn)的，這種現(xiàn)象被稱為“心肌缺血再灌注損傷”(I/R)〔1～3〕。因此，如何減輕或者逆轉(zhuǎn)這種損傷成為臨床上的研究重點。大量研究表明黃芪具有顯著的心肌保護作用，而黃芪甲苷作為黃芪中的中藥活性成分，是否也具有相同的功效，其中的生理機制又是如何？本文通過觀察大鼠心功能以及心肌細胞中Bax、Bcl-2以及半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3的改變，旨在探討黃芪甲苷對心肌細胞的保護作用及其機制。

1材料與方法

1.1動物選用清潔級雄性Wistar大鼠100只，體重240～360 g，由南京君科生物工程有限公司提供，實驗動物使用許可證號：XYDS(滬)2013-0025。

1.2材料和試劑黃芪甲苷由上海銳谷生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號：HWJG 2013025。兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人Bax、 Bcl-2以及caspase-3多克隆抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、免疫組化試劑盒、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)凋亡試劑盒由武漢博士德生物有限公司提供。

1.3分組適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機分為三組，假手術(shù)組33只，給予普通飼養(yǎng)生理鹽水2 ml·kg-1·d-1灌胃，2 w后僅在冠狀動脈左室支左心耳下緣進行穿線處理，但不結(jié)扎，未造成心肌缺血；模型組34只，普通飼養(yǎng)2 w生理鹽水2 ml·kg-1·d-1灌胃后，大鼠建立心肌I/R模型；干預(yù)組33只，大鼠在心肌I/R模型建立前，給予普通飼養(yǎng)的同時，進行黃芪甲苷10 mg·kg-1·d-1灌胃2 w。

1.4大鼠I/R模型制備大鼠心肌I/R模型建立步驟：①麻醉：以5 ml/kg為標(biāo)準(zhǔn)，用10%的水合氯醛進行腹腔注射；②插管保持呼吸通暢；③動脈插管監(jiān)測心率及平均動脈壓；④在冠狀動脈左室支左心耳下緣0.5 cm處進行穿線結(jié)扎；⑤阻斷灌狀血流10 min，將結(jié)扎線解開再灌注1 h。模型復(fù)制以六導(dǎo)心電圖進行評判，評判標(biāo)準(zhǔn)如下：①ST端抬高0.5 mV；②結(jié)扎處松開后，ST段下降1/2以上， R波振幅降低；③可見有心律失常或Q波，其中①、②為必要條件。在模型建立時，假手術(shù)組有4只大鼠在手術(shù)過程中出現(xiàn)呼吸道阻塞死亡，模型組大鼠有4只大鼠模型建立失敗，干預(yù)組有2只大鼠出現(xiàn)心臟驟停死亡，建模成功率為90%。

1.5心肌凋亡情況測定①將取得的心肌組織于4%的多聚甲醛中固定、脫水、浸蠟包埋；②切片并脫蠟；③磷酸鹽緩沖液洗滌；④加50 μl TUNEL檢測液；⑤30℃下避光孵育1 h；⑥磷酸鹽再次沖洗；⑦熒光顯微鏡下計數(shù)。凋亡指數(shù)(AI)計算公式：陽性細胞/總細胞數(shù)×100%。

1.6Bax、Bcl-2以及caspase-3測定采用免疫組織化學(xué)SP法：①將相應(yīng)的石蠟切片脫蠟；②室溫下，3%的過氧化氫滅活內(nèi)源性酶；③微波修復(fù)抗原；④蘇木精復(fù)染，脫水后封片鏡檢。以正常兔IgG代替一抗做對照。使用ImagePro Plus Analysis Software 6.0軟件在200倍顯微鏡下測量其吸光度，每張切片取5個視野，計算平均吸光度。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0進行正態(tài)性及方差齊性檢驗；單因素方差分析和LSD檢驗。

2結(jié)果

2.1各組大鼠心肌細胞凋亡結(jié)果比較于灌注24 h后，用TUNEL法對大鼠心肌細胞凋亡情況進行測定，藍色為正常細胞顯示內(nèi)容，棕色為陽性細胞細胞核顯示內(nèi)容(如圖1)。將結(jié)果輸入圖像分析軟件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組AI值有顯著性差異(F=12.562，P<0.05)。兩兩比較，模型組AI值〔(10.25±2.65)%〕顯著高于干預(yù)組〔(8.01±1.66)%〕及假手術(shù)組〔(5.31±1.23)%〕，干預(yù)組顯著高于假手術(shù)組(均P<0.05)。

圖1　心肌凋亡圖(×200)

2.2各組大鼠Bax、Bcl-2以及caspase-3平均吸光度比較三組間心肌組織中的Bax、Bcl-2以及caspase-3蛋白表達具有顯著性差異(F=19.56、21.02、16.98，均P<0.05)；兩兩比較，模型組及干預(yù)組的Bax、Bcl-2以及caspase-3蛋白的表達顯著高于假手術(shù)組，模型組的Bax、caspase-3蛋白顯著高于干預(yù)組(P<0.05)，模型組Bcl-2蛋白顯著低于干預(yù)組(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠Bax、Bcl-2以及caspase-3

與假手術(shù)組相比：1)P<0.05；與模型組相比：2)P<0.05

3討論

黃芪甲苷是中藥黃芪中的主要活性物質(zhì)之一，為皂苷類化合物。研究顯示，這種黃芪中的主要成分對缺血性再灌注損傷的心肌細胞具有較為顯著的保護作用〔4〕。然而其中的具體機制目前尚未明確。

心肌細胞的死亡方式主要為壞死和細胞凋亡，所以I/R所導(dǎo)致的心肌細胞凋亡也在此列。然而細胞凋亡是一個復(fù)雜的過程，其中多個基因參與到此過程中，其中最受關(guān)注的就是Bcl-2家族，而Bax和Bcl-2作為家族中的主要成員，Bcl-2主要的生理功能是抑制細胞凋亡，延長細胞壽命〔5〕。Bax的功能正好與此相反，具有促進細胞凋亡的作用，兩者可在細胞內(nèi)形成異源二聚體——Bax-Bcl-2，異源Bax-Bcl-2較為穩(wěn)定，無誘導(dǎo)凋亡作用，而當(dāng)Bax較Bcl-2升高時，則合成同源Bax-Bcl-2，可誘導(dǎo)凋亡〔6〕。caspase-3作為caspase家族中的一員，同樣在細胞凋亡過程中扮演重要角色，其誘導(dǎo)過程為蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，首先激活caspase，然后逐級活化細胞凋亡蛋白，最后激活執(zhí)行型caspase，最終作用于底物蛋白，使蛋白分解導(dǎo)致細胞凋亡〔7，8〕。

本研究結(jié)果提示黃芪甲苷對大鼠I/R的保護作用比較明顯；另外提示在I/R大鼠心肌細胞中存在較多的細胞凋亡和抗凋亡誘導(dǎo)因子，而黃芪甲苷對心肌細胞的保護作用可能同上調(diào)Bcl-2的表達、同時降低Bax的表達來實現(xiàn)。但本研究尚處于初級階段，尚需更加深入系統(tǒng)的研究。

4參考文獻

1Tian Y,Zhang W,Xia D,etal.Postconditioning inhibits myocardial apoptosis during prolonged reperfusion via a JAK2-STAT3-Bcl-2 pathway〔J〕.J Biomed Sci,2011;18(1):53.

2賀中民,謝艷華,王四旺,等.燈延顆粒對結(jié)扎冠狀動脈所致大鼠心肌缺血的影響〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2010;10(4):625-9,封3.

3Jennings RB.Historical perspective on the pathology of myocardial ischemia/reperflusion injury〔J〕.Circ Res,2013;113(4):428-38.

4Zhang WD,Chen H,Zhang C,etal.Astragaloside Ⅳ from Astragalus membranaceus shows cardioprotection during myocardial ischemia in vivo and in vitro〔J〕.Planta Med,2006;72(1):4-8.

5劉展,張明亮,張俐,等.胃癌及癌前病變中的細胞凋亡與Bcl-蛋白、P糖蛋白的表達及相關(guān)性研究〔J〕.南華大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2002;30(2):1.

6Gobe G,Rubin M,Williams G,etal.Apoptosis and expression of Bcl-2,Bcl-XL,and Bax in renal cell carcinomas〔J〕.Cancer Invest,2002;20(3):324-32.

7Doonan F,Cotter TG.Detection of DNA fragmentation inretinal apoptosis by TUNEL〔J〕.Methods Mol Biol,2013;935(2):207-13.

8Brot S,Rogemond V,Perrot V,etal.CRMP5 interacts with tubulin toinhibit neurite outgrowth,therebv modulating the function of CRMP2〔J〕.J Neurosci,2010;30(32):10639-54.

〔2015-04-15修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)