瑞舒伐他汀對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊中凋亡相關(guān)蛋白的影響

陳建昌高國(guó)潔李鳳玲郝躍偉劉偉魏金省

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院急診科，山東濟(jì)南 250022)

摘要〔〕目的觀察瑞舒伐他汀對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Caspase-3表達(dá)的影響。方法10只C57小鼠作為對(duì)照組，給予普通飲食，同品系22只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組(n=11)、干預(yù)組(n=11)，高脂喂養(yǎng)8 w后，干預(yù)組給予瑞舒伐他汀懸液灌胃，模型組給予等量生理鹽水。繼續(xù)喂養(yǎng)12 w后所有老鼠處死，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清血脂，光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠主動(dòng)脈斑塊形態(tài)及面積，免疫組化法檢測(cè)動(dòng)脈粥樣斑塊Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比較，模型組總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)明顯升高(P<0.05)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)明顯降低(P<0.05)；主動(dòng)脈可見明顯粥樣斑塊；Bcl-2表達(dá)明顯減少，Caspase-3表達(dá)明顯增多(P<0.05)。與模型組比較，TC、TG、LDL-C明顯降低(P<0.05)；干預(yù)組小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊面積減小(P<0.05)， Bcl-2表達(dá)明顯增多，Caspase-3表達(dá)明顯減少(P<0.05)。結(jié)論高脂飲食可引起ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Caspase-3的變化，瑞舒伐他汀可以通過(guò)上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Caspase-3的表達(dá)，抑制ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展。

關(guān)鍵詞〔〕瑞舒伐他?。?ApoE-/-小鼠； 動(dòng)脈粥樣硬化；Bcl-2； Caspase-3

中圖分類號(hào)〔〕R541.4〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：陳建昌(1962-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事急診急救醫(yī)學(xué)研究。

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)生發(fā)展中，高脂質(zhì)負(fù)荷及氧化修飾和炎癥差異調(diào)節(jié)著血管細(xì)胞的增殖、凋亡〔1〕。AS斑塊中常檢測(cè)到大量巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，造成內(nèi)皮功能障礙，脂質(zhì)核心增大，斑塊纖維帽變薄，形成不穩(wěn)定斑塊，易發(fā)生急性冠脈綜合征(ACS)〔2〕。他汀類藥物最初作為強(qiáng)有效的調(diào)脂藥物應(yīng)用于臨床，最新研究表明其可通過(guò)抗炎、抗氧化等作用穩(wěn)定斑塊，延緩甚至逆轉(zhuǎn)斑塊進(jìn)展，其獨(dú)立于調(diào)脂以外的作用機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)，目前仍有新的作用機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，其是否也通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因抑制細(xì)胞凋亡從而穩(wěn)定斑塊，尚不清楚。Bcl-2蛋白是體內(nèi)外凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要調(diào)節(jié)器，尤其在氧化應(yīng)激和炎癥導(dǎo)致的血管細(xì)胞凋亡中起重要調(diào)節(jié)作用〔1〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)瑞舒伐他汀對(duì)小鼠AS斑塊中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響，探究他汀類藥物對(duì)AS斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡的作用，為尋找AS新的治療靶點(diǎn)和干預(yù)措施提供了新思路。

1材料與方法

1.1材料與儀器雄性C57BL/6J小鼠、同品系A(chǔ)poE-/-小鼠購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2011-0012。高脂及普通飼料購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)部。瑞舒伐他汀鈣片(批號(hào)：H20060406)由阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)，用生理鹽水配置成懸液。一抗：Bcl-2、Caspase-1兔抗小鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Immunoway，公司，二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG多聚體、血脂測(cè)試試劑盒、PV9000免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自青島昊航科貿(mào)有限公司，顯微鏡攝像機(jī)、光學(xué)顯微鏡、切片機(jī)、全自動(dòng)血生化儀用自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)部。

1.2方法

1.2.1小鼠模型與分組健康雄性8周齡C57小鼠10只，體重(18.4±3.1)g為對(duì)照組，給予普通飼料喂養(yǎng)，同一品系健康雄性8周齡ApoE-/-小鼠22只，體重(19.2±2.3)g，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組與干預(yù)組，每組11只，均給予高脂飼料，喂養(yǎng)8 w后，給予干預(yù)組瑞舒伐他汀鈣懸液10 mg·kg-1·d-1灌胃，每次灌胃量0.2 ml，普通組給予等量生理鹽水灌胃，ApoE-/-小鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，對(duì)照組普通飼料喂養(yǎng)，飲水不限制，持續(xù)12 w，其中模型組因撕咬死亡1只，干預(yù)組因灌胃窒息死亡1只。

1.2.2血脂測(cè)定最后一次給藥后，所有小鼠禁食水12 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，眼球取血，每只小鼠取血量約0.5 ml左右，靜置2 h后以6 000 r/min，10 min高速離心，取上層血清，使用全自動(dòng)血生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.2.3病理形態(tài)學(xué)檢查取完血后快速打開小鼠胸腹腔，由主動(dòng)脈根部離斷血管，游離整個(gè)主動(dòng)脈剪斷，冰生理鹽水沖洗，快速放入4%中性多聚甲醛內(nèi)固定12 h。常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，Image-Pro Plus Version 6.0(IPP)圖像分析處理軟件計(jì)算小鼠管腔面積和斑塊面積。

1.2.4Bcl-2、Caspase-1免疫組化檢測(cè)取完血后取主動(dòng)脈，用冰生理鹽水沖洗，4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，以5 μm厚度切片，脫蠟、水化，放入抗原修復(fù)液中，將容器異同放入高壓鍋中加熱行高壓抗原修復(fù)，冷卻至室溫，PBS洗3次，3% H2O2去離子水孵育10 min，分別滴加一抗 Bcl-2、Caspase-1(1∶100)，4℃過(guò)夜，滴加二抗為辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG多聚體，室溫孵育20 min，PBS沖洗、DAB顯色后進(jìn)行蘇木素核復(fù)染，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野，Bcl-2、Caspase-1均以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，觀察并拍照，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量，取其平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS15.0軟件行配對(duì)t、χ2檢驗(yàn)及F檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組小鼠血脂檢測(cè)模型組ApoE-/- 小鼠TC、TG、LDL-C水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，HDL-C水平低于對(duì)照組(P<0.05)。干預(yù)組ApoE-/-小鼠TC、TG、LDL-C水平均低于模型組(P<0.05)，HDL-C水平升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組小鼠血脂水平的比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2小鼠血管壁病理改變HE染色顯示對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑無(wú)中斷，中膜、外膜分界清晰，與內(nèi)膜平行，細(xì)胞排列規(guī)則。模型組小鼠主動(dòng)脈壁層次尚清晰，內(nèi)膜明顯增厚，向管腔突出，內(nèi)皮細(xì)胞壞死、脫落造成內(nèi)膜中斷。中膜平滑肌細(xì)胞大量增殖，排列紊亂，侵入內(nèi)膜下，形成粥樣斑塊，內(nèi)見大量泡沫細(xì)胞及壞死灶。干預(yù)組較模型組內(nèi)膜增厚減輕，斑塊明顯縮小，病變程度減輕。見圖1，表2。

表2　各組小鼠主動(dòng)脈斑塊和管腔面積比較 ± s, n=10)

2.3小鼠主動(dòng)脈Caspase-3 、Bcl-2 免疫組化檢測(cè)對(duì)照組主動(dòng)脈細(xì)胞胞質(zhì)有少量棕黃色顆粒物表達(dá)。模型組與干預(yù)組均可見棕黃色Caspase-3 、Bcl-2 陽(yáng)性表達(dá)。與對(duì)照組相比，模型組平滑肌細(xì)胞內(nèi)、粥樣斑塊中Caspase-3 表達(dá)明顯增加，Bcl-2 陽(yáng)性表達(dá)減少但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，干預(yù)組平滑肌細(xì)胞、粥樣斑塊內(nèi)Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增加(P<0.05)，Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少(P<0.05)。見圖1、圖2，表3。

圖1　小鼠主動(dòng)脈Caspase-3表達(dá)(DAB，×400)

圖2　小鼠主動(dòng)脈Bcl-2表達(dá)(DAB，×400)

組別Caspase-3Bcl-2對(duì)照組7.1±2.25.2±1.2模型組15.6±2.31)4.2±1.5干預(yù)組10.5±2.32)9.6±3.42)

3討論

細(xì)胞凋亡是腫瘤、糖尿病等疾病的發(fā)生機(jī)制之一，近年來(lái)觀察發(fā)現(xiàn)，凋亡也廣泛參與AS的發(fā)生。研究表明AS斑塊浸潤(rùn)大量炎性細(xì)胞并且易發(fā)生細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致脂質(zhì)核心的形成〔3〕。血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的凋亡促進(jìn)脂質(zhì)沉積，核心增大，形成易損斑塊〔4〕。內(nèi)皮損傷是AS發(fā)生的起始環(huán)節(jié)〔5〕，據(jù)報(bào)道內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致AS斑塊不穩(wěn)定性，易血栓形成，導(dǎo)致ACS〔6〕。氧自由基或細(xì)胞內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物可以攻擊多不飽和脂肪酸，啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中最主要的是LDL被氧化成ox-LDL，ox-LDL與內(nèi)皮細(xì)胞上過(guò)表達(dá)的受體LOX-1結(jié)合，使 p38MAPK 磷酸化，激活Caspase-3，誘導(dǎo)NF-κB轉(zhuǎn)位到核膜，直接或間接的促進(jìn)Caspase-3的活化并下調(diào)bcl-2的表達(dá)，使內(nèi)皮細(xì)胞受損〔7〕，分泌功能紊亂，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抗氧化能力減弱。

巨噬細(xì)胞凋亡同樣參與AS進(jìn)展，富含巨噬細(xì)胞區(qū)域比如斑塊的“肩部”細(xì)胞凋亡通常要高于其他區(qū)域〔8〕，巨噬細(xì)胞吞噬過(guò)多的ox-LDL，發(fā)生凋亡后如未能及時(shí)被清除則發(fā)生繼發(fā)性壞死，壞死細(xì)胞碎片同時(shí)也是強(qiáng)烈的促炎因子，可誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，造成斑塊不穩(wěn)定性，易破裂導(dǎo)致ACS。Hartung等〔9〕制備了晚期AS斑塊模型，然后給予他汀類凋脂治療，觀察到粥樣硬化斑塊巨噬細(xì)胞炎性浸潤(rùn)減少和血管平滑肌細(xì)胞含量增加，而巨噬細(xì)胞凋亡明顯減少，從而表明巨噬細(xì)胞凋亡減少可能有助于斑塊的穩(wěn)定。Bcl-2 在AS斑塊平滑肌細(xì)胞中共表達(dá)，可與Bax 凋亡基因拮抗，調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的基質(zhì)分泌，阻止凋亡過(guò)度表達(dá)而使斑塊穩(wěn)定。

細(xì)胞凋亡有兩條誘導(dǎo)通路，一個(gè)是死亡受體通路另一個(gè)是細(xì)胞應(yīng)激途徑。這兩條通路都起始于Caspase-3的激活〔10〕因此Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶。線粒體在Caspase活化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。線粒體釋放細(xì)胞色素C到胞質(zhì)， 使前體Caspase-3 (32 kD)被激活，進(jìn)一步被切割為兩部分：p17片段(17 kD) 和p12 片段(12 kD)。Caspase通過(guò)識(shí)別核糖聚合酶PARP的裂解片段，誘導(dǎo)凋亡〔11〕。

Bcl-2 基因家族，是最重要的細(xì)胞凋亡控制基因，其編碼的Bcl-2抗凋亡蛋白，可以阻止化療藥物、紫外線輻射、自由基損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡〔12〕。Bcl-2家族可以調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡〔13〕。Bc l-2和Bax均屬于Bcl-2基因家族，促凋亡蛋白Bax可以插入線粒體外膜，進(jìn)入線粒體觸發(fā)凋亡因子釋放，如細(xì)胞色素C。同時(shí)，抗凋亡蛋白Bcl-2可以阻止線粒體分解及細(xì)胞色素C的釋放，從而組織細(xì)胞凋亡。Bai等〔14〕發(fā)現(xiàn)上調(diào)Bcl-2的表達(dá)可以減少細(xì)胞色素C的釋放，抑制oxLDL導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞凋亡。Bcl-2對(duì)Caspase有抑制作用，參與對(duì)Caspase活性的調(diào)節(jié)，可抑制過(guò)度表達(dá)Caspase-3所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。研究表明Bcl-2蛋白環(huán)區(qū)的天冬氨酸(Asp34)是Caspase-3的酶解位點(diǎn)，Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制同時(shí)受到Caspase-3的調(diào)節(jié)，Caspase-3能夠在Asp34的位置切割Bcl-2蛋白使其發(fā)生裂解，被裂解的Bcl-2可以向線粒體外膜轉(zhuǎn)移，通過(guò)BH3和跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞凋亡過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)成功通過(guò)高脂喂養(yǎng)AproE-/-小鼠構(gòu)建動(dòng)物AS模型，進(jìn)行瑞舒伐他汀干預(yù)可以明顯減小主動(dòng)脈AS斑塊，與Hartung等〔9〕研究一致。本研究表明，與對(duì)照組相比，通過(guò)免疫組化法檢測(cè)主動(dòng)脈壁Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠主動(dòng)脈Caspase-3、Bcl-2均有表達(dá)，Caspase-3表達(dá)明顯增多，陽(yáng)性細(xì)胞多聚集于粥樣硬化斑塊附近，尤其是脂質(zhì)核心和粥樣斑塊纖維帽肩部，而在正常小鼠血管壁內(nèi)很少見到陽(yáng)性細(xì)胞，說(shuō)明在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過(guò)程中，細(xì)胞凋亡發(fā)生頻繁，并激活抗凋亡蛋白。這可能是由于機(jī)體異常高脂血癥，促進(jìn)前體Caspase-3分割成有活性的Caspase-3，Caspase-3可以使Bcl-2酶解，減少了內(nèi)皮細(xì)胞 Bcl-2的表達(dá)，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡。與模型組相比較，瑞舒伐他汀干預(yù)組小鼠凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)水平降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平升高，在血管內(nèi)膜、中膜均有表達(dá)，說(shuō)明瑞舒伐他汀可能通過(guò)減少Caspase-3的活化并增加Bcl-2 的表達(dá)，改善血管細(xì)胞凋亡情況，減少內(nèi)皮細(xì)胞受損，抑制平滑肌細(xì)胞凋亡，減少巨噬細(xì)胞凋亡，穩(wěn)定斑塊，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。但本實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量有限，調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達(dá)的分子機(jī)制還不十分清楚，應(yīng)用于臨床還有一定距離。

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〔2014-09-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)