安神補(bǔ)腦軟膠囊對老年失眠模型大鼠下丘腦5-羥色胺1a、5-羥色胺2a、γ-氨基丁酸表達(dá)量的影響

王冰梅于江波王永彬陸韜吳迪于智莘

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117)

摘要〔〕目的觀察安神補(bǔ)腦軟膠囊對失眠大鼠下丘腦5-羥色胺(5-HT)1a、5-HT2a、γ-氨基丁酸(GABA)含量的影響。方法采用腹腔注射對氯苯丙氨酸(PCPA)法造模。造模成功后，隨機(jī)將動物分為老年模型組(模型組)、安神補(bǔ)腦軟膠囊高中低組(安神高中低組)、地西泮組；另設(shè)青年對照組(對照組)。分別給予安神補(bǔ)腦軟膠囊(24、12、6 g生藥/kg)、地西泮(0.525 mg/kg)，對照組、模型組給予相應(yīng)容量的蒸餾水，連續(xù)給藥7 d，熒光定量PCR檢測下丘腦內(nèi)5-HT1a、5-HT2a受體mRNA的表達(dá)，酶聯(lián)免疫法、免疫組化法檢測GABA含量。結(jié)果與模型組相比，各給藥組下丘腦5-HT1a表達(dá)量明顯升高，5-HT2a表達(dá)量明顯降低，GABA蛋白的表達(dá)明顯增多(均P<0.05)。結(jié)論安神補(bǔ)腦軟膠囊通過調(diào)節(jié)失眠模型大鼠下丘腦中5-HT1a、5-HT2a、GABA的表達(dá)發(fā)揮治療作用。

關(guān)鍵詞〔〕安神補(bǔ)腦軟膠囊；失眠；5-羥色胺1a；5-HT2a；γ-氨基丁酸

中圖分類號〔〕R749〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：2013年度吉林省博士后科研項目啟動經(jīng)費項目

通訊作者：于智莘(1977-)，女，博士，副教授，主要從事藥物制劑研究。

1吉林敖東藥業(yè)集團(tuán)有限公司博士后科研工作站

于江波(1965-)，男，研究員，主要從事藥學(xué)、制藥方面研究。

第一作者：王冰梅(1970-)，女，博士，在站博士后，副教授，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

安神補(bǔ)腦液用于神經(jīng)衰弱、失眠、健忘、頭暈、乏力等癥，臨床上療效顯著〔1〕。動物實驗結(jié)果表明，安神補(bǔ)腦液可明顯改善動物的睡眠質(zhì)量〔2〕；對記憶再現(xiàn)障礙有明顯的改善作用〔3〕。我們在不改變其原有提取工藝和服用劑量的前提下，將其改成軟膠囊劑，解決了其口服液制劑含糖、防腐劑以及成品運輸攜帶不便等缺點。本文觀察安神補(bǔ)腦軟膠囊對睡眠剝奪老年大鼠下丘腦白細(xì)胞介素(IL)-1β、γ-氨基丁酸(GABA)含量的影響，旨在證實安神補(bǔ)腦軟膠囊的療效及其作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1試劑及藥物對氯苯丙氨酸(PCPA)(Sigma公司)，Trizol總RNA提取試劑盒(上海生工)，TransScript Green Two-Step q RT-PCR SuperMix試劑盒(北京全式金)；PCR引物合成(上海生工)；安神補(bǔ)腦軟膠囊(吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司)，地西泮(江蘇濟(jì)川制藥有限公司)。

1.2實驗方法雄性Wistar大鼠，分為青年對照組、老年實驗組，其中對照組10只，實驗組若干只。實驗組動物以300 mg/kg劑量腹腔注射PCPA，連續(xù)給藥2 d；對照組注射生理鹽水。于第1次注射PCPA 48 h后應(yīng)用閾劑量戊巴比妥鈉(40 mg/kg)睡眠實驗，以大鼠睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間為指標(biāo)，評價造模成功與否。取模型制備成功的實驗組大鼠50只，隨機(jī)分為模型組、地西泮(0.6 mg/kg)組、安神補(bǔ)腦軟膠囊高、中、低(24、12、6 g生藥/kg)組，每組10只。各給藥組每日口服給藥，對照組及模型組每日灌以生理鹽水，連續(xù)給藥7 d。

1.3實時熒光定量PCR檢測下丘腦5-HT1a、5-HT2a受體mRNA的表達(dá)實驗結(jié)束后，于末次藥后2 h，各組動物在冰臺上斷頭取腦，液氮速凍，-80℃冰箱保存。采用Trizol總RNA提取試劑盒提取各組動物下丘腦總RNA；TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后測定下丘腦中的5-HT1a、5-HT2a受體mRNA的表達(dá)量。以GAPDH作內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析大鼠下丘腦5-HT1a、5-HT2a受體的基因相對表達(dá)量：循環(huán)閾值(ΔCt)=Ct樣品均值-Ct內(nèi)參均值，ΔΔCt=ΔCt-(Ct陰性對照樣品均值-Ct內(nèi)參均值)。

熒光定量PCR引物：GAPDH上游：5'-acatgccgcctggagaaacct-3'，下游：5'-gcccaggatgccctttagtgg-3'；5-HT1a上游：5'-ccgcacgcttccgaatcc-3'，下游：5'-tgtccgttcaggctcttcttg-3'；5-HT2a上游：5'-aacggtccatccacagag-3'，下游5'-aacaggaagaacacgatgc-3'。擴(kuò)增條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)。

1.4酶聯(lián)免疫法檢測下丘腦GABA含量取各組動物的下丘腦，冰浴中用勻漿器將標(biāo)本充分勻漿，3 000 r/min離心20 min，收集上清。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測下丘腦中GABA的含量。

1.5免疫組織化學(xué)SABC法檢測下丘腦GABA的表達(dá)按試劑盒說明書操作，GABA多克隆抗體(1∶200)，4℃過夜，DAB顯色。GABA陽性細(xì)胞呈棕黃色。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件在400倍視野下選取相應(yīng)區(qū)域4個不重疊視野，檢測陽性染色部位的積分光密度(IOD)值。按平均IOD=IOD/面積計算，重復(fù)6次取其均值表示GABA的相對表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS15.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗。

2結(jié)果

2.1安神補(bǔ)腦軟膠囊對老年失眠模型大鼠下丘腦5-HT1a、5-HT2a mRNA表達(dá)量與模型組比較，各給藥組下丘腦5-HT1a mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01，P<0.05)；5-HT2a mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01，P<0.05)，見表1。

2.2安神補(bǔ)腦軟膠囊對老年失眠模型大鼠下丘腦GABA含量的影響與模型組〔(4.38±1.92)μg/g〕比較，各給藥組GABA含量明顯增加(P<0.05)，且具劑量依賴性。其中安神高組(10.27±2.45)μg/g，安神中組(9.16±2.10)μg/g，安神低組(7.18±1.48)μg/g，地西泮組(12.16±3.03)μg/g，對照組(15.84±2.46)μg/g。

2.3安神補(bǔ)腦軟膠囊對老年失眠模型大鼠下丘腦GABA陽性細(xì)胞表達(dá)量的影響與模型組(90.78±18.18)相比，各給藥組大鼠下丘腦GABA 陽性細(xì)胞染色較深，表達(dá)量也明顯增多，其中安神高組GABA灰度值為(173.56±34.16)，安神中組為(163.51±32.68)，安神低組(131.83±27.44)，地西泮組為(175.89±35.24)，對照組為213.21±25.04。半定量評分結(jié)果表明，各給藥組GABA表達(dá)較模型組明顯增強(qiáng)(P<0.05)。見圖1。

表1　各組下丘腦5-HT1a、5-HT2a mRNA

與模型組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

圖1　各組大鼠下丘腦GABA免疫組化染色比較(×200)

3討論

睡眠是機(jī)體必不可少的生理過程，也是促進(jìn)機(jī)體體力恢復(fù)及生長發(fā)育的重要過程，長期的睡眠不足或睡眠障礙，而老年人由于各種原因，常出現(xiàn)不同程度的睡眠障礙，在臨床上發(fā)病率較高。而在治療失眠的中藥制劑中，安神補(bǔ)腦軟膠囊多年來臨床應(yīng)用取得了良好的療效。下丘腦前部存在著睡眠中樞，下丘腦后部有喚醒中樞，當(dāng)睡眠中樞受到抑制而喚醒中樞興奮性不足時，則發(fā)生丘腦-皮質(zhì)投射神經(jīng)元去極化，引起持續(xù)喚醒，從而導(dǎo)致睡眠障礙。與之興奮性改變相關(guān)有著多種單胺類遞質(zhì)，可引起睡眠和喚醒交替進(jìn)行。

王慧等〔4〕實驗證明，酸棗仁湯能減少失眠模型大鼠中縫背核星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，改善神經(jīng)細(xì)胞損傷程度；張林挺等〔5〕證明酸棗仁湯可以降低大鼠腦內(nèi)c-fos和c-jun基因的表達(dá)來治療失眠。朱蕾等〔6〕證實刺五加可能是通過調(diào)節(jié)失眠引起的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、加速5-HT 的代謝轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)NE 的異常、提高海馬組織中AchE活性來影響睡眠的。

5-HT神經(jīng)元廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在觸發(fā)和維持睡眠中起重要作用。5-HT合成抑制劑PCPA可拮抗5-HT前體(5HTP)引起失眠，腹腔注射PCPA 引起的大鼠失眠是公認(rèn)的動物失眠模型。在已知的5-HT的7個受體中，與抗失眠研究相關(guān)性最高的是5-HT1a和5-HT2a受體。5HT1a受體激動藥具有減少快速動眼睡眠(REM)、增加REM潛伏期、升高腦內(nèi)5HT含量的作用〔7〕，這可能是5HT1a受體激動藥可以用于治療失眠的機(jī)制之一。而研究表明〔8〕，5-HT2a受體拮抗劑可增加慢波睡眠(SWS)和非快速動眼睡眠(NREM)，減少覺醒次數(shù)且無對于REM的影響，因此認(rèn)為5-HT2a受體拮抗藥物是治療失眠的比較理想藥物。本研究提示其可能是通過影響下丘腦內(nèi)5-HT1a、5-HT2a受體表達(dá)調(diào)節(jié)下丘腦內(nèi)5-HT能系統(tǒng)的作用，從而起到治療失眠的作用。

GABA是存在于中神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性氨基酸類遞質(zhì)，對睡眠的調(diào)節(jié)有著重要的影響。本研究提示，安神補(bǔ)腦軟膠囊能夠提高失眠模型大鼠下丘腦GABA含量及其在神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)，對失眠模型大鼠下丘腦GABA神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)有促進(jìn)作用，且呈現(xiàn)量效關(guān)系，可以通過激活腦內(nèi)抑制性單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，增加中樞對睡眠中樞的控制從而起到治療失眠的作用。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-03-18修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)