轉(zhuǎn)化生長因子-β1對巨噬細(xì)胞泡沫化過程的影響及其機(jī)制

張鳳香賀成業(yè)李晨光羅俊生

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心外科，遼寧錦州121001)

摘要〔〕目的研究轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是否能通過膽固醇酯水解酶(CEH)對巨噬細(xì)胞的泡沫化過程產(chǎn)生影響。方法ox-LDL(100 mg/L)作用48 h，使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞；Ad-TGF-β1和(或)siRNA CEH作用于巨噬細(xì)胞,作用48 h后,分別采用油紅O染色檢測陽性細(xì)胞數(shù)量；HPLC觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝情況；Western印跡檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)CD36和SR-A1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果油紅O染色陽性細(xì)胞數(shù)量：空白對照組59.54±4.01、Ad-TGF-β1組15.12±1.23、Ad-TGF-β1+ siRNA CEH組89.01±3.67、siRNA CEH組94.28±5.22。巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯(CE)、游離膽固醇(FC)和總膽固醇(TC)含量；與空白對照組比較，Ad-TGF-β1+siRNA CEH組和siRNA CEH組均增加(P<0.05)；而Ad-TGF-β1組均明顯下降 (P<0.05)。Western印跡法檢測發(fā)現(xiàn)：與空白對照組比較，Ad-TGF-β1組CD36和SR-A1蛋白表達(dá)均明顯低于；而Ad-TGF-β1+siRNA CEH組和siRNA CEH組CD36和SR-A1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。結(jié)論TGF-β1是通過提高CEH的表達(dá)來抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞〔〕轉(zhuǎn)化生長因子-β1; 膽固醇酯水解酶；CD36；清道夫受體A1

中圖分類號〔〕R581；R54〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金(2013022010)；遼寧醫(yī)學(xué)院青年科技啟動

通訊作者：羅俊生(1968-)，男，博士后，主任醫(yī)師，主要從事動脈粥樣硬化研究。。

第一作者：張鳳香(1978-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事動脈粥樣硬化研究。

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，而巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞是 AS 形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，抑制巨噬細(xì)胞源性的泡沫細(xì)胞形成是預(yù)防AS 形成的重要步驟。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是一種具有多種生物學(xué)功能的生長因子,當(dāng)TGF-β1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)生變化時可以影響巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化〔1〕。但目前TGF-β1影響巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞的具體機(jī)制尚不得而知。前期研究證明，在巨噬細(xì)胞內(nèi)TGF-β1的表達(dá)與CEH的表達(dá)呈正相關(guān)。本文探討TGF-β1能否通過CEH來影響巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

1材料和方法

1.1 材料THP-1人單核巨噬細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞庫;ox-LDL購自北京生物技術(shù)公司;胎牛血清和胰蛋白酶購自碧云天公司; 兔抗鼠SR-A單克隆抗體、兔抗鼠和CD36單克隆抗體、小鼠抗β-actin 單克隆抗體、PCR試劑盒、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠二抗均購自北京中杉金橋公司；羊抗兔二抗購自Jackson IR Labs公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司；人源重組腺病毒載體Ad-TGF-β1購自Gibco公司；siRNA CEH購自QIAGEN公司。

1.2 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化形成及分組凍存的人 THP-1 單核細(xì)胞置于 37℃水浴中 1 min 內(nèi)快速復(fù)蘇，培養(yǎng)于 含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于 37℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔 3～5 d傳代1次，細(xì)胞密度為1×106個/ml。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，然后加入ox-LDL(100 mg/L)共同培養(yǎng)48 h,誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成。將誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞分為4組：①空白對照組；②Ad-TGF-β1組;③Ad-TGF-β1+siRNA CEH組；④siRNA CEH組，再培養(yǎng)48 h，隨后收集細(xì)胞。

1.3 油紅O染色及脂質(zhì)染色的半定量分析將油紅 O 儲存液與蒸餾水按 3∶2 比例混合，靜置 5 min 后雙層濾紙過濾(全過程避光)；將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)液洗2遍，吸干水分；室溫下 10%甲醛固定 30 min；用配制好的油紅染液避光染 40 min；60%異丙醇洗脫10 s；用蒸餾水洗去異丙醇，封片。 根據(jù)細(xì)胞脂滴的面積進(jìn)行細(xì)胞分類;細(xì)胞脂滴的面積小于細(xì)胞核的面積記為“-”;細(xì)胞脂滴的面積≥細(xì)胞核的面積記為“+”,即為油紅O染色細(xì)胞;每塊玻片計(jì)數(shù)100個細(xì)胞。

1.4 高效液相色譜分析(HPLC)分析細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量待細(xì)胞處理結(jié)束后,棄去培養(yǎng)基,PBS液洗3遍;加入1 ml 0.9% NaCl溶液重新稀釋細(xì)胞,反復(fù)凍融,冰浴中超聲裂解細(xì)胞(600 W,20 s)。4℃、10 000 r/min離心15 min,辛可酸液進(jìn)行蛋白定量;將細(xì)胞溶解產(chǎn)物分為等體積的兩組;加入等體積的新鮮配制的15%KOH醇溶液,室溫渦旋至細(xì)胞溶解產(chǎn)物清亮;分別加入6%的三氯乙酸去蛋白。 再加入等體積的正己烷∶異丙醇溶液(4∶1,V/V),將混合物渦旋5 min;1 500 r/min速度離心 5 min。收集上層有機(jī)相;將下層水相按上述方法重復(fù)抽提 2次; 將混合的有機(jī)相在真空冷凍干燥機(jī)中干燥,在室溫冷卻;加入100 μl異丙醇∶正庚烷∶乙腈(35∶12∶52,V/V) 將樣本溶解,活性炭去色素;超聲除氣 5 min,1 500 r/min離心 5 min,收集上清液;取10 μl進(jìn)樣,進(jìn)行HPLC分析，檢測膽固醇酯(CE)、游離膽固醇(FC)、總膽固醇(TC)。

1.5 Western印跡法檢測裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白,BCA試劑盒定量。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,恒壓電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,5%脫脂牛奶封閉1 h,清道夫受體(SR)-A(1∶500) 和CD36(1∶1 000)37℃孵育2 h,TBST洗膜3次，每次10 min，后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶500)，4℃孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，凝膠成像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，兩樣本的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 Ad-TGF-β1和(或)siRNA CEH對巨噬細(xì)胞泡沫化的影響空白對照組陽性細(xì)胞數(shù)量為59.54±4.01、Ad-TGF-β1組陽性細(xì)胞數(shù)量為15.12±1.23、Ad-TGF-β1+siRNA CEH組陽性細(xì)胞數(shù)量為89.01±3.67、siRNA CEH組陽性細(xì)胞數(shù)量為94.28±5.22。與空白對照組比較,Ad-TGF-β1+siRNA CEH組和siRNA CEH組陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)，但Ad-TGF-β1+siRNA CEH組和siRNA CEH組陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯差異(P>0.05)；而Ad-TGF-β1組陽性細(xì)胞與空白對照組比較陽性細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.05)。見圖1。

2.2 Ad-TGF-β1和/或siRNA CEH對巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的影響HPLC檢測結(jié)果顯示：與空白對照組比較，Ad-TGF-β1+siRNA CEH組和siRNA CEH組巨噬細(xì)胞內(nèi)CE、FC和TC含量均增加(P<0.05)；而Ad-TGF-β1組與空白對照組比較巨噬細(xì)胞內(nèi)CE、FC和TC含量均明顯下降 (P<0.05)。說明Ad-TGF-β1可以減少CE在細(xì)胞內(nèi)聚集并加強(qiáng)FC的流出(均P<0.05)。見表1。

2.3 Ad-TGF-β1和(或)siRNA CEH對巨噬細(xì)胞中CD36和SR-A1蛋白表達(dá)的影響見圖2。Ad-TGF-β1組CD36和清道夫受體(SR)-A1蛋白表達(dá)均明顯低于空白對照組；而Ad-TGF-β1+siRNA CEH組和siRNA CEH組CD36和SR-A1蛋白表達(dá)明顯高于空白對照組(P<0.05)。

圖1　油紅O染色顯示各組巨噬細(xì)胞泡沫化情況(×400)

組別CE(mg/ml)FC(mg/ml)TC(mg/ml)CE/TC(%)空白對照組50.17±3.1137.21±1.0376.23±4.2565.76±2.37Ad-TGF-β1組11.57±2.011)9.58±1.021)42.59±2.351)27.10±2.011)Ad-TGF-β1+siRNACEH組79.54±5.021)52.65±3.121)98.16±4.231)81.03±2.121)siRNACEH組86.21±3.251)59.06±2.541)106.01±5.221)81.31±3.041)

與空白對照組比較：1)P<0.05

1.siRNA CEH 組;2.Ad-TGF-β1 組;3.Ad-TGF-β1+siRNA CEH組;4.空白對照組 圖2　Western印跡檢測各組巨噬細(xì)胞CD36和 SR-A1蛋白表達(dá)的影響

3討論

泡沫細(xì)胞的形成是AS的顯著特征。血液系統(tǒng)中的單核巨噬細(xì)胞遷移到血管內(nèi)皮下吞噬大量脂質(zhì)后形成泡沫細(xì)胞,泡沫細(xì)胞釋放的CE和FC在血管壁損傷處大量聚集形成了AS斑塊脂質(zhì)核心。近來研究表明,CEH介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)CE水解作用,能夠促進(jìn)CE水解為FC,并促進(jìn)FC外流到細(xì)胞外受體,從而同時減少了細(xì)胞內(nèi)CE和FC的聚集〔2〕。 TGF-β1屬TGF-β超家族，是一種分子量為25 000 kD的多肽,是由巨噬細(xì)胞、血小板、血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞等分泌,在AS發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用〔3〕。研究表明巨噬細(xì)胞攝取脂蛋白和巨噬細(xì)胞泡沫化轉(zhuǎn)化的形成與巨噬細(xì)胞TGF-β1濃度呈負(fù)相關(guān)，但其具體機(jī)制尚不清楚〔4〕。本研究結(jié)果說明增加TGF-β1的表達(dá)可以有效抑制細(xì)胞泡沫化,減少CE在細(xì)胞內(nèi)聚集并加強(qiáng)FC的流出,抑制泡沫細(xì)胞的形成。但當(dāng)沉默CEH的表達(dá)時TGF-β1這種抑制泡沫細(xì)胞形成的作用卻被明顯降低。巨噬細(xì)胞可以表達(dá)多種SRs,包括SR-A、SR-BI、CD36、CD68及磷脂酰絲氨酸和氧化脂蛋白的SR，其中CD36和SR-A被認(rèn)為是主要的致AS受體，在AS的形成過程中起重要作用〔5～7〕。研究證實(shí)，SR-A、CD36介導(dǎo)的膽固醇流入直接影響了巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞的程度〔8，9]。同時研究還發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能通過影響SR-A和CD36的表達(dá)來抑制AS的發(fā)生、發(fā)展過程，但具體機(jī)制尚不清楚〔10，11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，TGF-β1可能是通過CEH來影響CD36和SR-A1的表達(dá)的。綜上，TGF-β1可能是通過CEH來影響巨噬細(xì)胞的泡沫化進(jìn)程。

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〔2013-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)