異甘草素對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制的影響及機(jī)制

張瑞城鐘良寶梁海琴周桔豐

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，海南海口570102)

摘要〔〕目的探討異甘草素對(duì)黃嘌呤氧化酶(XO)的抑制作用機(jī)制。方法采用酶抑制動(dòng)力學(xué)方法，研究異甘草素對(duì)XO的抑制作用和失活動(dòng)力學(xué)，研究異甘草素對(duì)高尿酸小鼠尿酸(BUA)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)含量及XO活性的影響。結(jié)果異甘草素對(duì)XO有良好的抑制作用〔半抑制濃度(IC50)為(19.32±2.23)μmol/L〕，失活動(dòng)力學(xué)分析木犀草素能夠快速抑制XO的活性，此外異甘草素能夠明顯的降低高尿酸小鼠BUA、Cr和BUN含量及XO活性(Pc<0.05，Pb<0.01)。結(jié)論異甘草素作為一種XO抑制劑，能夠快速誘導(dǎo)了XO活性的降低和BUA、Cr和BUN含量的降低，對(duì)調(diào)節(jié)患者尿酸水平起到重要作用，為臨床抗高尿酸血癥和痛風(fēng)提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞〔〕異甘草素；黃嘌呤氧化酶；高尿酸小鼠；尿酸

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20158333)

通訊作者：周桔豐(1979-)，女，營(yíng)養(yǎng)師，主管護(hù)師，主要從事腎臟疾病營(yíng)養(yǎng)與代謝研究。

第一作者：張瑞城(1976-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事慢性腎臟疾病基礎(chǔ)與臨床研究。

黃嘌呤氧化酶(XO)可以在機(jī)體內(nèi)催化嘌呤類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生尿酸(BUA)，并伴隨著自由基的生成，當(dāng)體內(nèi)XO活性異常活躍時(shí)，嘌呤代謝而產(chǎn)生的BUA量增加，BUA在血液中最大飽和度為416.5 μmol/L，當(dāng)濃度超過(guò)這個(gè)臨界值時(shí)，BUA在體內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶〔1〕，出現(xiàn)急性的生理炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)高BUA血癥〔2〕，進(jìn)而引起痛風(fēng)的發(fā)作〔3〕。通過(guò)抑制XO的活性能夠抑制BUA的生成，并調(diào)整BUA在新陳代謝中的平衡，因此，XO抑制劑可以從根源上很好地控制、減輕高BUA血癥和痛風(fēng)。異甘草素屬于黃酮類(lèi)中的異黃酮類(lèi)化合物，存在于豆科植物〔4～6〕中，具有較強(qiáng)的抗病毒、抗炎、抗血管生成、催眠等活性，其中，其降BUA作用是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。本課題研究異甘草素對(duì)XO的抑制作用和失活動(dòng)力學(xué)，以期為異甘草素在降BUA治療領(lǐng)域更有效的應(yīng)用提供理論參考。

1材料與方法

1.1儀器與試劑本實(shí)驗(yàn)選用動(dòng)物模型為ICR小鼠30只，質(zhì)量為(20±2)g(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)；XO從牛乳中提取、氧嗪酸鉀鹽(Sigma公司)，其標(biāo)準(zhǔn)溶液用pH 7.5的磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L)進(jìn)行配制；黃嘌呤(Sigma公司)，異甘草素、別嘌呤醇(阿拉丁試劑有限公司)；緩沖體系為pH 7.5的磷酸鹽(50 mmol/L)。

UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；血BUA檢測(cè)試劑盒(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；Millipore Simplicity水純化系統(tǒng)(法國(guó)密理博公司)；pHs-3C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；肌酐(Cr)、XO、 尿素氮(BUN)檢測(cè)試劑盒(阿拉丁試劑有限公司)。

1.2方法

1.2.1異甘草素對(duì)XO的抑制能力測(cè)定XO催化黃嘌呤產(chǎn)生BUA(在290 nm處有特征吸收峰)，參考文獻(xiàn)〔7〕的方法，在37℃下、XO(1×10-7mol/L)和不同濃度的異甘草素孵化3 h后，加入黃嘌呤，利用UV-2450紫外分光光度計(jì)的動(dòng)力學(xué)/時(shí)間軟件，在290 nm處的吸光值每隔30 s測(cè)定1次，計(jì)算在含有不同異甘草素濃度的體系下XO的相對(duì)活性。

1.2.2異甘草素存在下，XO的失活動(dòng)力學(xué)測(cè)定在37℃，相同的緩沖體系下，每隔3 min從不同濃度的異甘草素與XO孵化體系中取出相同體積的孵化液，加入底物，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的動(dòng)力學(xué)/時(shí)間軟件測(cè)定XO失活的時(shí)間進(jìn)程，并測(cè)定異甘草素存在下XO的失活速率。

1.2.3小鼠BUA、Cr和BUN含量及XO活性測(cè)定除正常組外，其他組均給予腹腔注射氧嗪酸鉀鹽，作為高BUA血癥模型。在對(duì)小鼠注射氧嗪酸鉀鹽1 h后，從小鼠的眼眶后靜脈叢進(jìn)行采血，25℃靜置1 h，之后3 500 r/min離心15 min，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)Cr、BUA和BUN含量；同時(shí)取小鼠肝臟的同一部位約100 mg，加入10 ml生理鹽水，并以8 000 r/min的速度勻漿20 min，使其組織充分勻漿化，之后將勻漿液以3 500 r/min的速度離心15 min，進(jìn)行XO活性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果

2.1異甘草素對(duì)XO的抑制作用隨著異甘草素(0～100 μmol/L)和別嘌呤醇(0～50 μmol/L)濃度的增加，XO的活性不斷降低；當(dāng)異甘草素的濃度達(dá)到50 μmol/L時(shí)，其對(duì)XO的抑制能力趨于平緩，解析異甘草素和別嘌呤醇對(duì)XO的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(19.32±2.23)μmol/L和(6.21±0.63)μmol/L。見(jiàn)圖1。

2.2XO的失活動(dòng)力學(xué)研究在不同異甘草素濃度存在下，XO的相對(duì)活性隨著異甘草素孵化時(shí)間的增加并沒(méi)有發(fā)生變化。見(jiàn)圖2。

2.3異甘草素對(duì)小鼠BUA、Cr和BUN含量及XO活性的影響模型組的BUA、Cr和BUN含量及XO活性明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照別嘌呤醇組的BUA、Cr和BUN含量及XO活性明顯低于模型組(P<0.01)；隨著異甘草素組濃度的增大，BUA、Cr和BUN含量及XO活性越來(lái)越明顯的低于模型組，在中劑量(25 μmol/L，P<0.05)和高劑量(75 μmol/L，P<0.01)時(shí)，BUA、Cr和BUN含量及XO活性明顯低于模型組。見(jiàn)表1。

圖1　異甘草素對(duì)XO活性的影響

圖2　異甘草素抑制XO的時(shí)間進(jìn)程

組別XO活性(mmol/L)Cr(mmol/L)BUN(mmol/L)BUA(mmol/L)空白對(duì)照組48.56±3.1742.17±3.117.99±3.3857.23±2.35模型組62.21±1.321)138.32±6.121)20.12±2.631)152.11±5.311)別嘌呤醇組40.55±2.522)58.32±4.122)9.45±3.312)72.33±4.262)異甘草素組(5μmol/L)60.14±3.31129.23±4.3119.23±1.56137.22±4.28異甘草素組(25μmol/L)57.11±2.123)115.23±7.232)16.34±3.453)119.32±2.192)異甘草素組(75μmol/L)49.72±4.232)72.34±2.992)13.89±3.162)85.22±6.232)

與空白對(duì)照組相比:1)P<0.01，與模型組相比:2)P<0.01，3)P<0.05

3討論

目前是對(duì)高UA血癥和痛風(fēng)的藥物治療可分為三種類(lèi)型：一類(lèi)是藥物通過(guò)降低或者減輕痛風(fēng)帶來(lái)的炎癥反應(yīng)來(lái)達(dá)到治療的目的。第二種是通過(guò)生物體內(nèi)BUA排泄的增加，而達(dá)到降低血BUA的效果。第三種是能夠抑制BUA生成的藥物，即XO抑制劑〔8〕。目前臨床上用于抑制XO活性的抑制劑主要是別嘌呤醇，是一種競(jìng)爭(zhēng)性嘌呤類(lèi)似物抑制劑，也是次黃嘌呤的異構(gòu)體，它能夠與酶活性中心的 Mo(Ⅳ)牢固結(jié)合，使 Mo(Ⅳ)不能輕易轉(zhuǎn)變?yōu)?Mo(Ⅵ)，進(jìn)而抑制了BUA的生成〔9〕。但別嘌呤醇會(huì)引發(fā)毒副作用，因此，研究新的安全無(wú)副作用的XO抑制劑具有十分重要的意義。天然產(chǎn)物有效成分的XO的抑制劑來(lái)源廣泛，安全性高，引起了廣泛的關(guān)注。(1)食物來(lái)源的XO抑制劑，主要為生姜、山藥和蒜〔10〕，蜂膠〔11〕，玉米〔12〕；(2)中藥來(lái)源的XO抑制劑，主要為樗白皮〔13〕，卷柏屬種〔14〕，買(mǎi)麻藤〔15〕、丹參〔16〕、土連翹〔17〕，金銀花〔18〕。從以上抑制劑來(lái)源結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)物質(zhì)和酚酸類(lèi)成分具有良好的XO抑制活性。且黃酮類(lèi)化合物安全、有效，越來(lái)越成為治療痛風(fēng)藥物開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)。然而，植物成分的藥理藥效不明，又制約了它的開(kāi)發(fā)，因此，探討具有功能性因子的天然活性成分對(duì)XO抑制機(jī)制的研究是迫切需要的。本文研究表明，異甘草素能夠有效降低高BUA小鼠BUA、Cr和BUN含量及XO活性，此外，異甘草素對(duì)XO的抑制作用具有濃度依賴(lài)性，并能夠改變酶的生理結(jié)構(gòu)和性質(zhì)〔10〕。

抑制劑與酶的結(jié)合強(qiáng)弱、結(jié)合速度等直接關(guān)系到其對(duì)酶的抑制作用，藥物的治療效應(yīng)以及藥物的副作用。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)異甘草素能夠輕松的與XO發(fā)生作用或者改變XO的構(gòu)象，使酶的活性得到快速的抑制，且在短時(shí)間內(nèi)失活，這意味著異甘草素能夠使XO的穩(wěn)定態(tài)活力均快速下降，逐漸干擾底物與XO的結(jié)合，使尿酸含量在短時(shí)間內(nèi)得以控制，及時(shí)緩解病人痛苦，值得臨床推廣。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-04-17修回〕

(編輯袁左鳴)