沒食子酸誘導人宮頸癌Hela細胞凋亡的機制

羅強任鴻1孫黎郭春燕

(河北北方學院生命科學研究中心，河北張家口075000)

摘要〔〕目的體外觀察沒食子酸對人宮頸癌Hela生長及凋亡的影響，探討其抗腫瘤作用。方法體外培養(yǎng)Hela細胞，用不同濃度的沒食子酸作用為實驗組，同時設(shè)對照組，以CCK8法測細胞增殖抑制作用、流式細胞儀檢測p53和Bcl-2蛋白表達情況，掃描電鏡下觀察細胞形態(tài)的改變。結(jié)果不同濃度沒食子酸作用Hela細胞24 h增殖抑制顯著(P<0.05)，其抑制效應具有劑量依賴性，同時誘導Hela細胞凋亡、上調(diào)p53基因表達、下調(diào)Bcl-2基因表達(P<0.05)。結(jié)論沒食子酸可抑制Hela細胞的生長且隨藥物劑量的增加而升高，并可誘導腫瘤細胞凋亡，其抗腫瘤效應可能與細胞的基因調(diào)控有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕沒食子酸；Hela； CCK-8； p53；Bcl-2；凋亡

中圖分類號〔〕R73〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河北省教育廳資助項目(2007302)

1河北北方學院附屬第一醫(yī)院體檢中心

第一作者：羅強(1977-)，男，實驗師，主要從事細胞生物學及抗腫瘤機制研究。

沒食子酸又名五倍子酸、棓酸,化學名3,4,5-三羥基苯甲酸(C7H6O5),為白色或淡黃色針狀結(jié)晶或粉末,通常是以一水化合物的形式存在,是一種重要的有機原料,廣泛用于化工、醫(yī)藥、食品、染料、輕工及電子等行業(yè)〔1〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸具備一定的抗病毒、抗真菌、抗腫瘤作用〔2〕,且毒性很低,可作為一種潛在的阻止腫瘤發(fā)生的化學預防劑〔3〕。但是,對沒食子酸抗腫瘤效果仍有爭議〔4〕。本研究觀察沒食子酸對人宮頸癌細胞增殖凋亡作用探討其抗腫瘤效應。

1材料與方法

1.1 主要試劑和儀器人宮頸癌細胞株Hela由北京大學腫瘤防治研究所惠贈。RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(天津市川頁生化制品有限公司),CCK-8(上海同仁化學)，碘化丙啶(PI)深圳晶美生物工程有限公司產(chǎn)品；FITC-p53、PE-bcl-2(美國BD公司)。美國SpectraMax M2e 多功能微孔板檢測系統(tǒng),美國 FACSA ria流式細胞儀，日本HITACHI S-3400N掃描電鏡。

1.2 Hela細胞培養(yǎng)細胞用含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用不同濃度沒食子酸處理。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖抑制取對數(shù)生長期的Hela細胞5×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板,100 μl/孔。 用RPMI1640培養(yǎng)液將沒食子酸稀釋成7個不同濃度(0.02，0.04，0.08，0.16，0.32,0.64，1.28 mg/L)，分別加入96孔培養(yǎng)板(100 μl/孔),每組設(shè)4個復孔，對照組加入等體積培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。然后每孔加入CCK-8 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h,之后用SpectraMax M2/M2e多功能微孔板檢測系統(tǒng)測吸光度(A490 nm值),按公式計算細胞抑制率；抑制率(%)=(1-實驗組平均A490 nm值/對照組平均A490 nm值)×100%。

1.4 流式細胞儀檢測p53，bcl-2蛋白表達取對數(shù)生長期Hela細胞(密度為1×106/ml)分別接種于4個50 ml的培養(yǎng)瓶中,貼壁后換不同濃度的沒食子酸培養(yǎng)液(0.08、0.16、0.32 ng/L)， 對照組加入等量培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后,收集細胞，分別加入20 μl FITC-p53及PE-bcl-2孵育20 min,上流式細胞儀檢測。

1.5 掃描電鏡觀察將蓋玻片高壓處理后放于六孔板中，取對數(shù)生長期Hela細胞(密度為1×106/ml)分別接種到6孔板，使細胞貼附于蓋玻片上，再用不同濃度的沒食子酸作用，使用掃描電鏡觀察形態(tài)。

1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS11.0軟件進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1 沒食子酸對Hela細胞增殖的影響CCK-8法檢測0.02，0.04，0.08，0.16，0.32,0.64，1.28 mg/L 7個不同濃度的沒食子酸作用Hela細胞24 h，對Hela細胞的生長均得到明顯的抑制，并且隨著藥物濃度增加，對Hela細胞抑制率增加且生存率下降。見表1。

表1　沒食子酸對Hela細胞增殖的影響

與對照組比較：1)P<0.05

2.2 沒食子酸對Hela細胞p53和bcl-2表達的影響經(jīng)0.16，0.32,0.64 mg/L 3個不同濃度的沒食子酸作用Hela細胞24 h后，與對照組相比，p53表達明顯增高，bcl-2表達顯著降低，用藥前后均有顯著差異，且沒食子酸對Hela細胞的作用呈劑量依賴性。見表2。

2.3 沒食子酸對Hela細胞形態(tài)的影響經(jīng)0.32,0.640 mg/L 2個不同濃度的沒食子酸作用Hela細胞24 h后，與對照組相比，細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，細胞間連接中斷，外形皺縮，表面塌陷，形成凋亡小體，見圖1。

圖1　沒食子酸對Hela細胞形態(tài)的影響(掃描電鏡)

組別 p53 bcl-2 均值t值均值t值對照組1.68±0.10-3.49±0.11-0.16mg/L組3.51±0.13-26.8541)3.52±0.060.0570.32mg/L組7.92±0.07-52.0812)1.56±0.0940.7622)0.64mg/L組15.11±0.09-110.2492)0.79±0.0622.7252)

與對照組比較：1)P<0.05,與前濃度組比較：2)P<0.05

3討論

沒食子酸作為一種有機酸類,易被消化道所吸收,其作用機制已較明確,因其對肝臟、腎臟、心血管有較強的親和力,生物學效應比較廣泛〔5，6〕,沒食子酸還具有抗氧化作用〔7，8〕。選擇毒副作用低或無毒副作用的腫瘤藥物治療策略,是臨床不斷探索的難題〔9〕。細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下,遵循自身的程序,自己結(jié)束生命的過程,最后細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體,被其他細胞吞噬,并且在形態(tài)上有一定特征〔10，11〕。中藥抗腫瘤作用的最重要機制之一是誘導腫瘤細胞的凋亡,從而抑制腫瘤的進一步惡化,乃至全部消滅殘留的腫瘤細胞〔12〕。bcl-2 蛋白家族是細胞凋亡相關(guān)基因研究中研究得最多的一類蛋白質(zhì)〔13〕。p53 基因?qū)毎蛲龅恼{(diào)控是研究得較多的〔14〕。p53 基因?qū)Ψ乐辜毎錾捅３諨NA 受損基因組的完整性有重要作用〔15〕。應用轉(zhuǎn)基因方法研究發(fā)現(xiàn)： 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的bcl-2 可能通過阻斷鈣離子 Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)中的流動,使依賴 Ca2+的核酸內(nèi)切酶活性降低,從而阻斷細胞凋亡〔16〕。有學者認為bcl-2 通過抗氧化劑或抑制氧自由基的產(chǎn)生而發(fā)揮其抑制細胞凋亡的功能〔17〕。p53 調(diào) 控 一 些 僅 有 BH3 區(qū) 域 的 蛋 白 ,作 為Bax/Bak的上游調(diào)控機制,誘導細胞凋亡〔18，19〕。流式細胞術(shù)結(jié)果表明沒食子酸具有上調(diào)抑癌基因p53的表達，下調(diào)癌基因bcl-2的表達作用，而誘發(fā)Hela細胞凋亡。

4參考文獻

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〔2013-12-18修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)