胰島素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲特性及增殖能力的影響

劉曉梅鄭輝陳尚吳萍萍1

(蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，江蘇蘇州215009)

摘要〔〕目的探討不同濃度胰島素對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2侵襲特性及體外增殖能力的影響及其可能機(jī)制。方法將人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于不同胰島素濃度的高糖培養(yǎng)基中，應(yīng)用預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室檢測(cè)不同胰島素濃度對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響；應(yīng)用PI單染流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)不同濃度胰島素對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響；運(yùn)用CCK-8方法檢測(cè)不同濃度胰島素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響；同時(shí)應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)不同胰島素濃度培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中MMP-2、、MMP-9轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果在一定濃度范圍內(nèi)，HepG2細(xì)胞的侵襲能力與胰島素濃度成正相關(guān)(P<0.05)；在一定濃度范圍內(nèi)，高濃度胰島素能促進(jìn)HepG2細(xì)胞的體外增殖能力，并加快HepG2細(xì)胞G0/G1至S期轉(zhuǎn)換，加快細(xì)胞周期的進(jìn)展(P<0.05)；在一定濃度范圍內(nèi)，HepG2細(xì)胞MMP-2、MMP-9轉(zhuǎn)錄水平與胰島素濃度成正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論在一定濃度范圍內(nèi)，胰島素可能通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)水平促進(jìn)HepG2的侵襲能力，并通過驅(qū)動(dòng)HepG2細(xì)胞G0/G1至S期轉(zhuǎn)換促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖能力。

關(guān)鍵詞〔〕HepG2細(xì)胞；高胰島素；侵襲；基質(zhì)金屬蛋白酶；增殖

中圖分類號(hào)〔〕R446.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：江蘇省衛(wèi)生廳衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)教育研究立項(xiàng)課題(No.JZ201101)

1蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)中心

第一作者：劉曉梅(1972-)，女，教授，碩士，主要從事高職基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)研究。

2010年美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)(ADA)和美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)(ACS)聯(lián)合發(fā)表共識(shí)聲明指出糖尿病(主要為2型)與包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，相關(guān)數(shù)據(jù)分析顯示，糖尿病患者原發(fā)性肝癌發(fā)生的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)約為一般人群的2倍以上〔1〕。一般認(rèn)為糖尿病可通過數(shù)種機(jī)制來(lái)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子受體軸、高胰島素血癥、高血糖或慢性炎癥等〔2〕。在2型糖尿病中普遍存在高胰島素血癥被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)，但其確切機(jī)制尚不清楚〔3〕。本研究探討高糖環(huán)境中不同濃度的胰島素對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2侵襲特性及增殖能力的影響及其可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料及儀器肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，8 μm Transwell板購(gòu)自美國(guó)corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司，總mRNA提取Trizol試劑盒購(gòu)自南京生興生物公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，PCR引物合成于蘇州金唯智技術(shù)有限公司，CCK-8試劑購(gòu)自日本同仁株式會(huì)，細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，GENMED結(jié)晶紫細(xì)胞染色試劑購(gòu)自上海杰美醫(yī)藥科技有限公司，胰島素購(gòu)自江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組陰性對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)，無(wú)胰島素干預(yù)；胰島素干預(yù)組分為1×10-8mmol/L胰島素組、1×10-6mmol/L胰島素組、1×10-4mmol/L胰島素組。

1.3細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，常規(guī)消化計(jì)數(shù)，重懸于不同胰島素濃度的無(wú)血清高糖DMEM中，并調(diào)整濃度至2×105個(gè)/ml，取150 μl細(xì)胞懸液接種到預(yù)鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室中，Transwell小室外面加入600 μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。48 h后，用棉簽輕輕擦除小室上層的細(xì)胞，并參照說(shuō)明書用GENMED結(jié)晶紫細(xì)胞染色試劑盒將Transwell小室下層細(xì)胞著色，每孔隨機(jī)選取10個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)分析，分析細(xì)胞侵襲能力的變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，常規(guī)消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104個(gè)/ml,然后將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μl細(xì)胞懸液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞每天更換不同胰島素濃度的新培養(yǎng)基。每板設(shè)4組細(xì)胞，每組5個(gè)重復(fù)孔，共鋪6個(gè)板。自第一天起，每天用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。在避光條件下每孔加10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育90 min。然后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，共6 d，作出生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞DNA分布在6孔板中培養(yǎng)各組細(xì)胞密度至70%～80%，常規(guī)制備單細(xì)胞懸液，收集至離心管中，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次。預(yù)冷的1 ml PBS再次重懸細(xì)胞，逐滴加入3 ml預(yù)冷的無(wú)水乙醇，4℃固定過夜后去除上清，并用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。然后加入100 μl Rnase A 37℃水浴30 min。再加入400 μl PI染色混勻，4℃避光孵育30 min。用流式細(xì)胞儀在488 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，分析各組細(xì)胞DNA分布。重復(fù)3次。

1.6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)與侵襲遷移相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平的變化按照總mRNA Trizol提取試劑盒與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明提取細(xì)胞總mRNA，并將4 μg mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取1 μl cDNA進(jìn)行20 μl體系PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果用Quentity One軟件進(jìn)行拍照分析。PCR引物如下：MMP-2上游引物,5’-AGGCAAGTGACTTCTCAGTTTCT-3’，下游引物,5’-TATCCATCGCCATGCTCCCA-3’；MMP-9上游引物，5’-TTCAGGGAGACGCCCATTTC-3’，下游引物，5’-TGGGTGTAGAGTCTCTCGCT-3’；GAPDH上游引物,5’-ATGGGCAGCCGTTAGGAAAG-3’，下游引物,5’-GCAAATGAGCCCCAGCCTTC-3’。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1不同濃度胰島素在體外對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響在侵襲實(shí)驗(yàn)中，無(wú)胰島素組、1×10-8mmol/L胰島素組、1×10-6mmol/L胰島素組、1×10-4mmol/L胰島素組穿過Transwell小室基膜的細(xì)胞數(shù)分別為(35.3±2.9)、(39.7±3.5)、(53.7±3.2)及(81.7±2.9)，各組間穿膜細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明胰島素能顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞侵襲和遷移能力，并在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。見圖1。

2.2不同濃度胰島素在體外對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響隨著胰島素濃度的增加，HepG2細(xì)胞的增殖能力逐漸增加，且在1×10-4mmol/L時(shí)胰島素的促增殖作用異常顯著，各濃度組間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖1　倒置顯微鏡白光下所拍穿過Transwell小室基底膜 各組細(xì)胞的情況(×100)

圖2　各組細(xì)胞的增殖曲線

圖3　各組細(xì)胞細(xì)胞周期分析圖

2.3不同濃度胰島素在體外對(duì)HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響隨著胰島素濃度的增加，處于S期的細(xì)胞比例逐漸增加，處于G1期的細(xì)胞比例逐漸減少，胰島素干預(yù)組較無(wú)胰島素干預(yù)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3和表1。這說(shuō)明胰島素可加快HepG2細(xì)胞G0/G1至S期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)HepG2細(xì)胞周期進(jìn)展。

表1　不同濃度胰島素對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響 ± s)

與無(wú)胰島素干預(yù)組比較：1)P<0.05

2.4不同濃度胰島素在體外對(duì)HepG2細(xì)胞中金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)-2、MMP-9轉(zhuǎn)錄水平的影響隨著胰島素濃度的升高，HepG2細(xì)胞中MMP-2、MMP-9轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

M：marker，A：無(wú)胰島素干預(yù)，B：1×10 -8 mol/L，C：1×10 -6 mol/L，D：1×10 -4 mol/L 圖4　RT-PCR檢測(cè)不同濃度胰島素干預(yù)后HepG2 細(xì)胞中MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)水平變化

3討論

越來(lái)越多的證據(jù)顯示糖尿病是肝癌發(fā)生發(fā)展過程中獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素和術(shù)后復(fù)發(fā)的重要預(yù)后指標(biāo)，糖尿病與原發(fā)性肝癌之間存在密切的關(guān)系〔4,5〕。2型糖尿病以胰島素抵抗為主要特征，胰島素抵抗致使胰島素分泌代償性增加，胰島素是一種多功能激素類蛋白質(zhì)，也是人體細(xì)胞重要的生長(zhǎng)因子，體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)研究表明，高濃度胰島素能通過多種途徑促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展〔3,6〕，但其具體機(jī)制尚不明確。

腫瘤細(xì)胞快速、不可控性增殖是其癌變特性的最直接表現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的這種生物學(xué)特性決定了其較正常組織代謝旺盛，尤以惡性腫瘤更為明顯，為了滿足腫瘤細(xì)胞的迅速生長(zhǎng)和分裂需要，其物質(zhì)代謝發(fā)生了一系列特征性改變。而胰島素作為細(xì)胞代謝中不可或缺的調(diào)控因子，其與癌細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系一直備受關(guān)注〔7,8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，胰島素可通過加快HepG2細(xì)胞周期進(jìn)程、促進(jìn)細(xì)胞的分裂從而促進(jìn)其增殖能力。

侵襲性生長(zhǎng)是惡性肝癌細(xì)胞最顯著的臨床病理學(xué)特點(diǎn)之一，也是其肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的重要原因。本試驗(yàn)表明，高濃度胰島素可能是肝癌惡化的重要原因。侵襲是一個(gè)多因素參與的、多步驟的高度協(xié)調(diào)過程，主要涉及以下三個(gè)步驟：腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的黏附、腫瘤細(xì)胞分泌蛋白水解酶水解ECM以及細(xì)胞遷移出基底膜。其中ECM的降解被認(rèn)為是整個(gè)侵襲行為的關(guān)鍵步驟〔9〕。MMPs是存在于肝癌細(xì)胞中重要的蛋白水解酶，能夠有效降解ECM，大量報(bào)道表明，MMPs在惡性肝癌中過度表達(dá)，且其表達(dá)水平與肝癌的惡性程度密切相關(guān)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度胰島素可能是通過增加MMP-2、MMP-9轉(zhuǎn)錄活性而促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲能力。

4參考文獻(xiàn)

1Nagaoke Y,Hyogo H,Aikata H,etal.Recent trend of clinical features in patients with hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepatol Res,2012;42(4):368-75.

2Hemkens LG,Grouven U,Bender R,etal.Risk of malignancies in patients with diabetes treated with human insulin or insulin analogues:a cohort study〔J〕.Diabetologia,2009;52(9):1732-44.

3Pisani P.Hyper-insulinaemia and cancer,meta-analyses of epidemiological studies〔J〕.Arch Physiol Biochem,2008;114(1):63-70.

4Singh S,Singh PP,Singh AG,etal.Anti-diabetic medications and the risk of hepatocellular cancer:a systematic review and meta-analysis〔J〕.Am J Gastroenterol,2013;108(6):881-91,92.

5盧瑜.糖尿病與惡性腫瘤關(guān)系的回顧性臨床研究〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志,2010;3(26):183-7.

6Gallagher EJ,Leroith D.The proliferating role of insulin and insulin-like growth factors in cancer〔J〕.Trends Endocrinol Metab,2010；21(10):610-8.

7Booy S,Van Eijck CH,Janssen JA,etal.IFN-beta is a potent inhibitor of insulin and insulin like growth factor stimulated proliferation and migration in human pancreatic cancer cells〔J〕.Am J Cancer Res,2015;5(6):2035-46.

8Pivovarova O,Von Loeffelholz C,Ilkavets I,etal.Modulation of insulin degrading enzyme activity and liver cell proliferation〔J〕.Cell Cycle,2015;14(14): 2293-300.

9Von Deiming A,Fimmers R,Schmidt MC,etal.Comprehensive allelotype and genetic anaysis of 466 human nervous system tumors〔J〕.J Neuropathol Experim Neurol,2000;59(6):544-58.

10Ha TY,Hwang S,Moon KM,etal.Sorafenib inhibits migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells through suppression of matrix metalloproteinase expression〔J〕.Anticancer Res,2015;35(4):1967-76.

〔2014-06-19修回〕

(編輯苑云杰)