苦參堿對胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)miRNA表達(dá)的影響和靶點分析

李海龍1陳兆峰2劉敏2楊雅麗1王晶1吳紅彥1

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730000)

摘要〔〕目的探討苦參堿對化療藥物的增敏作用和機制。方法以非毒性劑量的苦參堿聯(lián)合長春新堿、阿霉素、5-氟尿嘧啶干預(yù)胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞，觀察苦參堿對胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞耐藥性的增敏作用；采用實時熒光定量PCR觀察苦參堿干預(yù)后耐藥相關(guān)miRNA的表達(dá)，并應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測和分析相關(guān)miRNA的靶基因和信號通路，應(yīng)用GO分析方法進(jìn)行了靶基因的功能注釋。結(jié)果苦參堿可以增強胃癌SGC-7901/DDP細(xì)胞對化療藥物的敏感性，逆轉(zhuǎn)耐藥；苦參堿可以劑量依賴性上調(diào)耐藥相關(guān)mir-7、mir-125b、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-146a的表達(dá)，生物信息學(xué)方法預(yù)測和分析了其靶基因和相關(guān)信號通路，并篩選出耐藥相關(guān)miRNA靶向調(diào)控的耐藥基因和DNA修復(fù)基因，為苦參堿克服胃癌化療多藥耐藥提供了靶點。結(jié)論苦參堿可以增強胃癌SGC-7901/DDP細(xì)胞對化療藥物的敏感性；其作用可能與苦參堿可以上調(diào)耐藥相關(guān)mir-7、mir-125b、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-146a的表達(dá)，并通過miRNA靶向調(diào)控的耐藥基因和DNA修復(fù)基因有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕苦參堿；SGC7901/DDP；腫瘤多藥耐藥；miRNA

中圖分類號〔〕R73-36+1〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：甘肅省中藥藥理與毒理實驗室開放課題(No.ZDSYS-KJ-2012-003)；中醫(yī)學(xué)院中青年項目(BH2010-071)

1甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實驗室甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點實驗室

2蘭州大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科

第一作者：李海龍(1975-)，男，副教授，主要從事中藥抗腫瘤藥理研究。

多藥耐藥性(MDR)是指腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性的同時，對結(jié)構(gòu)和作用機制不同的多種抗腫瘤藥物亦產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象，從而大大降低了抗腫瘤藥物的療效?？鄥A是豆科槐屬植物苦參和廣豆根中分離出來的一種生物堿，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的作用等多方面的藥理作用和功效，其中有研究表明氧化苦參堿或苦參堿可以逆轉(zhuǎn)多種腫瘤細(xì)胞的耐藥性〔1～4〕。近來發(fā)現(xiàn)有microRNA通過調(diào)節(jié)一些相關(guān)的基因參與了腫瘤細(xì)胞耐藥現(xiàn)象的發(fā)生〔5〕。本研究分析苦參堿調(diào)節(jié)胃癌SGC-7901/DDP對化療藥物敏感作用及其對胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)miRNA表達(dá)的影響和生物信息學(xué)。

1材料與方法

1.1材料RPMI1640 (GIBCO公司)，小牛血清(蘭州榮曄生物公司)、四唑鹽(MTT，Sigma公司)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)、苦參堿(陜西寶雞方晟生物公司)、順鉑(DDP)、阿霉素(ADM，深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號：1104E1)、長春新堿(VCR，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：110101)、5-氟尿嘧啶(5-FU，旭東海普，批號：110305)、SGC7901/DDP購自上海博谷生物公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組SGC7901/DDP細(xì)胞接種于含10% 小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在培養(yǎng)體系中加入終濃度為1 mg/L的DDP以維持耐藥性，置37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液傳代培養(yǎng)。實驗前無藥培養(yǎng)2 w。以SGC7901/DDP為實驗?zāi)Ｐ图硬煌瑵舛瓤鄥A為實驗組，每組各設(shè)3個平行實驗。

1.3MTT法檢測細(xì)胞藥敏性及對化療藥物的增敏作用取對數(shù)生長期的兩種細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，用RPMI-1640培養(yǎng)液制備成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為1×104個，體積為200 μl。細(xì)胞培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞處于對數(shù)生長期。在96孔板中加入非細(xì)胞毒性藥物劑量的苦參堿，參照VCR、ADM及5-FU的血漿高峰濃度(VCR 0.5 μg/ml，ADM 0.4 μg/ml，5-FU 10 μg/ml)加入不同濃度(0.01，0.1，1，10，100×PPC)的各化療藥物。于37℃，5%CO2下培養(yǎng)48 h，每孔加入新配置的MTT 20 μl，37℃下再培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄去上清液；每孔加入DMSO150 μl，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇570 nm波長在酶標(biāo)儀上檢測，取每3個平行孔A570 nm值的平均數(shù)，采用常規(guī)MTT法，計算抑制率，確定抑制率≤10%的藥物濃度為該藥的非細(xì)胞毒性濃度。

1.4實時熒光定量PCR法檢測胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)miRNA的表達(dá)采用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，檢測RNA的含量和純度(A260 nm/A280 nm=1.8～2.0)。以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性(28 S和18 S RNA條帶比值≥2.0)。用1 μg細(xì)胞總RNA進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄，以U6 snRNA 作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCT法計算各濃度苦參堿SGC7901/DDP 細(xì)胞與SGC7901/DDP細(xì)胞之間目標(biāo)miRNA表達(dá)水平的差異(以比值表示，SGC7901/DDP細(xì)胞的目標(biāo) miRNA 表達(dá)水平設(shè)為1)。其中ΔΔCt=ΔCt干預(yù)后SGC7901/DDP-ΔCt SGC7901/DDP；ΔCt=Ct miRNA-Ct U6。Ct 為反應(yīng)的實時熒光強度達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)，此時擴增是呈對數(shù)期增長。實驗重復(fù)三次，U6、mir-7、mir-125b、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-146a特異性引物由基因復(fù)能生物公司設(shè)計合。

1.5miRNA靶基因的生物信息學(xué)分析對mir-7、mir-125b、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-146a的靶基因使用mirfocus網(wǎng)站的生物信息學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測分析，信號通路分析采用KEGG Pathway、Biocarta Pathway軟件富集分析，并對靶基因進(jìn)行了基因功能注釋即GO分析，檢驗水準(zhǔn)為P<0.05。

1.6miRNA靶向調(diào)控的耐藥基因的生物信息學(xué)分析應(yīng)用以mirWALK網(wǎng)站的生物信息學(xué)分析軟件miRanda、miRDB、miRWalk、RNA22、TargetScan檢索篩選靶向調(diào)控耐藥基因：ABCB1 (MDR1)，ABCC1 (MRP1)，ABCC2 (MRP2)，ABCC3 (MRP3)，ABCC5 (MRP5)，ABCG2 (BCRP)，BAX，BCL2，BCL2L1 (BCL-X)，MVP (LRP)，RB1，TOP1，TOP2A，TOP2B，TP53，和DNA修復(fù)基因APC，ATM，BRCA1，BRCA2，ERCC3，MSH2，XPA，XPC的miRNA，其中包含生物信息學(xué)預(yù)測的miRNA靶基因，也包括已經(jīng)生物學(xué)驗證的miRNA靶基因，以檢索出的結(jié)果至少需要三個軟件分析支持才列為篩選結(jié)果。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.00軟件行方差分析和t檢驗。

2結(jié)果

2.1苦參堿對胃癌SGC7901/DDP耐藥細(xì)胞增殖的影響苦參堿體外處理SGC7901/DDP耐藥細(xì)胞后，SGC7901/DDP細(xì)胞增殖被明顯抑制。隨著苦參堿劑量的增加抑制作用逐漸增強。當(dāng)0.5，1.0，1.5和2.0 mg/L的苦參堿作用SGC7901/DDP細(xì)胞24 h時，SGC7901/DDP細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)到(8.78±1.15)%、(27.65±3.68)%、(48.98±5.24)%和(74.35±6.50) %。

2.2苦參堿對UCR、ADM和5-FU干預(yù)SGC7901/DDP耐藥細(xì)胞的增敏作用0.5 mg/L的苦參堿聯(lián)合不同濃度(0.01，0.1，1，10，100倍PPC)的VCR、ADM和5-FU干預(yù)后，對SGC7901/DDP耐藥細(xì)胞的抑制率明顯高于單純以同濃度的VCR、ADM和5-FU干預(yù)。見表1。

2.3苦參堿對SGC7901/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)miRNA表達(dá)的影響不同濃度的氧化苦參堿干預(yù)SGC7901/DDP細(xì)胞后，mir-7、mir-125b、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-146a的表達(dá)均出現(xiàn)了明顯的劑量依賴性上調(diào)表達(dá)(P<0.01)。見表2。

2.4miRNA靶向調(diào)控的耐藥基因的生物信息學(xué)分析分析結(jié)果見表3、圖1。

表1　苦參堿聯(lián)合VCR、ADM和5-FU干預(yù)SGC7901/DDP耐藥細(xì)胞的增殖抑制率

與單純同濃度VCR、ADM、5-FU比較：1)P<0.01

表2　苦參堿對SGC7901/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)miRNA

與對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.001

表3　SGC7901/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)miRNA的靶向調(diào)控耐藥

圖1　miRNA與靶向調(diào)控的耐藥基因的network

3討論

腫瘤多藥耐藥是臨床化療失敗的主要原因之一，但其耐藥性機制至今尚未完全闡明。MicroRNA(miRNA)是一類長度為18～25個核糖核苷酸的非編碼內(nèi)源性單鏈小分子RNA，由基因組DNA編碼，與靶標(biāo)基因 3′非翻譯區(qū)(3′UTR)不完全互補結(jié)合，進(jìn)而抑制翻譯；或與靶標(biāo)基因 3′UTR 完全互補結(jié)合，最后導(dǎo)致靶 mRNA 的降解，從而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控〔6〕。microRNA在多種生理和病理過程中發(fā)揮作用，大約50%的microRNA位于腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)〔7〕。miRNA對多基因表達(dá)的調(diào)控具有高效性和特異性，對靶基因的異常調(diào)控可能構(gòu)成腫瘤耐藥機制，是腫瘤耐藥復(fù)雜性調(diào)控的重要構(gòu)成部分。例如，在胃癌中均發(fā)現(xiàn)一些 microRNA 參與了腫瘤耐藥〔8～10〕。

因此，探討增強DDP、5-FU等化療藥物的敏感性，降低耐藥性對腫瘤化療意義重大，而逆轉(zhuǎn)DDP、5-FU的miRNA耐藥標(biāo)志物，是逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，增強化療敏感性的重要手段，本研究顯示，苦參堿干預(yù)SGC7901/DDP細(xì)胞24h后，mir-7、mir-125b、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-146a出現(xiàn)劑量依賴性的升高，生物信息學(xué)分析這些miRNA上調(diào)之后，所靶向調(diào)控的基因有數(shù)百個之多，信號通路涉及數(shù)十個，基因功能分類涉及腫瘤代謝、增殖、耐藥等多各方面，經(jīng)mirwalk網(wǎng)站的生物信息學(xué)軟件檢索并篩選，其靶向調(diào)控的耐藥基因有ABCB1 (MDR1)，ABCC1 (MRP1)，ABCC2 (MRP2)，ABCC3 (MRP3)，ABCC5 (MRP5)，ABCG2 (BCRP)，BAX，BCL2，BCL2L1 (BCL-X)，MVP (LRP)，RB1，TOP1，TOP2A，TOP2B，TP53；DNA修復(fù)基因有APC，ATM，BRCA1，BRCA2，ERCC3，MSH2，XPA，XPC。

陳勇等〔11，12〕使用microRNA 芯片檢測出胃癌DDP耐藥 SGC7901/DDP 細(xì)胞及其親本SGC7901之間 microRNA的表達(dá)差異，其中microRNA-200c下調(diào)超過了兩倍，智慧〔13〕應(yīng)用microRNA 芯片與對照的SGC-790細(xì)胞相比，SGC7901/VCR 細(xì)胞中miR-125b表達(dá)下調(diào)倍數(shù)為2.12倍；Wu等〔14〕用SRB方法分析6個羥喜樹堿(HCPT)耐藥性胃癌細(xì)胞株(BGC-823，SGC-7901，MGC-803，HGC-27，NCI-N87和AGS)對羥喜樹堿的敏感性，在耐藥性細(xì)胞株中有25種miRNA產(chǎn)生異常，其中miR-200家族和miR-7出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，轉(zhuǎn)染 miR-125b模擬物可顯著上調(diào)耐藥細(xì)胞中miR-125b表達(dá)水平，并顯著增加耐藥細(xì)胞對化療藥物的敏感性，熒光素酶實驗證實BCL2，MCL1是miR-125b的靶基因；上調(diào)microRNA-200c 的表達(dá)能顯著增加 SGC7901/DDP細(xì)胞在體外對DDP、ADM、5-FU及紫杉醇四種抗腫瘤藥物的敏感性，發(fā)揮化療增敏作用。因此，針對耐藥相關(guān)的microRNA，進(jìn)行過表達(dá)或抑制手段，是克服腫瘤耐藥的重要方法，但其缺憾是只能針對單個靶點干預(yù)；而運用中藥干預(yù)的優(yōu)勢明顯，其針對microRNA多靶點的干預(yù)可調(diào)控若干耐藥基因表達(dá)實現(xiàn)化療增敏和克服耐藥。另外，苦參堿干預(yù) SGC7901/CDDP細(xì)胞后，可通過miRNA引起的差異表達(dá)的非耐藥靶基因則數(shù)量龐大，所實現(xiàn)的功能調(diào)節(jié)也涉及若干方面，尤其對mir-200a、mir-200b的表達(dá)影響尤其顯著。

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〔2014-04-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)