蛇床子素通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路減輕糖尿病腦病的炎癥反應(yīng)

毛小元周宏灝劉昭前

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所，湖南長(zhǎng)沙410008；中南大學(xué)臨床藥理研究所湖南省遺傳藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410078)

摘要〔〕目的探討蛇床子素(OST)對(duì)糖尿病腦病的神經(jīng)保護(hù)作用及其分子機(jī)制。方法應(yīng)用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OST對(duì)糖尿病大鼠模型學(xué)習(xí)記憶的影響；應(yīng)用試劑盒法檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組海馬中膽堿酯酶(AChE)和膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、炎癥因子(包括NF-κB p65、TNF-α和IL-1β)和caspase-3的活性；應(yīng)用Western印跡方法檢測(cè)檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組海馬中磷酸化Akt(p-Akt)蛋白的表達(dá)。結(jié)果OST改善了糖尿病大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力，降低了糖尿病大鼠模型組海馬中AChE和炎癥因子(包括NF-κB p65、TNF-α和IL-1β)及cascapse-3的活性(P<0.01)，提高了ChAT的活性(P<0.01)，降低了p-Akt蛋白的表達(dá)(P<0.01)。同時(shí)，當(dāng)使用LY294002阻斷PI3K后，OST抑制炎癥的作用更為明顯，且進(jìn)一步下調(diào)了p-Akt蛋白的表達(dá)。結(jié)論OST對(duì)糖尿病腦病大鼠模型具有神經(jīng)保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其可能成為臨床上緩解糖尿病患者并發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙的新型治療藥物。

關(guān)鍵詞〔〕蛇床子素；糖尿病腦病；神經(jīng)保護(hù)；炎癥；PI3K；Akt；caspase-3

中圖分類號(hào)〔〕R587.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81302750)

第一作者：毛小元(1984-)，男，博士，講師，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)和臨床藥理學(xué)研究。

Osthole alleviates the inflammation in rats with diabetes-associated cognitive decline via inhibiting PI3K/Akt signaling pathway

MAO Xiao-Yuan, ZHOU Hong-Hao, LIU Zhao-Qian.

Institute of Clinical Pharmacology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan, China; Institute of Clinical Pharmacology, Hunan Key Laboratory of Pharmacogenetics, Central South University, Changsha 410078, Hunan, China

Abstract【】ObjectiveTo explore the neuroprotective effects of osthole in rats with diabetes-associated cognitive decline (DACD) and potential molecular mechanisms. MethodsThe learning and memory performance were assessed by Morris water maze test; The activities of AChE, ChAT, inflammatory cytokines including NF-κB p65, TNF-α and IL-1β and caspase-3 in the hippocampus were detected by respective commercial kits; Western blot analysis was employed to determine the protein level of phosphor-Akt (p-Akt) in the hippocampus.ResultsOsthole significantly improved learning and memory functions in diabetic groups. Additionally, the activities of AChE and inflammatory cytokines including NF-κB p65, TNF-α and IL-1β and caspase-3 in the hippocampus were all remarkably decreased, while increased ChAT was found in diabetic rats. Furthermore, osthole also diminished the protein expression of p-Akt in diabetic rats.ConclusionsOsthole exerts protective potential against DACD and this neuroprotection is associated with suppressing PI3K/Akt-mediated inflammation in diabetic rats. It is likely to be a novel therapeutic drug for the treatment of diabetic patients with cognitive deficits in clinical practice.

【Key words】Osthole; Diabetes-associated cognitive decline; Neuroprotection; Inflammation; PI3K; Akt; caspase-3

糖尿病腦病是糖尿病發(fā)生過(guò)程中的主要并發(fā)癥，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能減退，同時(shí)伴有大腦結(jié)構(gòu)及神經(jīng)生理等方面的病理性改變〔1，2〕。糖尿病患者發(fā)生學(xué)習(xí)記憶障礙的概率是普通健康人群的兩倍〔3〕。目前糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，但是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)高血糖可能是糖尿病腦病發(fā)生的關(guān)鍵因素，通過(guò)對(duì)血糖的控制可以顯著改善糖尿病并發(fā)的認(rèn)知功能障礙〔4〕。蛇床子素(OST)具有抗炎、抗氧化及延緩細(xì)胞衰老等作用〔5，6〕；但是否對(duì)糖尿病腦病具有保護(hù)作用，目前尚不清楚。本研究旨在探索OST對(duì)糖尿病大鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用從而為治療糖尿病腦病提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物、主要試劑和儀器成年3月齡雄性Wistar大鼠80只，體重210～230 g，由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。STZ，LY294002和OST(美國(guó)Sigma公司)。鹽酸多奈哌齊片(中國(guó)衛(wèi)材藥業(yè))。糖過(guò)氧化物酶診斷試劑盒(印度Span Diagnostic公司)。膽堿酯酶(AChE)和膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(ChAT)活性檢測(cè)試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所)。caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。小鼠抗大鼠p-Akt和Ak抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。DYY-5型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(北京六一儀器)，Centrifuge 5810R低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)BioRad公司)。

1.2糖尿病大鼠模型制作及藥物干預(yù)Wistar大鼠適應(yīng)1 w后，隨機(jī)選取72只Wistar大鼠給予STZ(0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液pH4.5稀釋)65 mg/kg一次性腹腔注射，其余8只大鼠給予等劑量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射作為對(duì)照組。給予STZ 72 h之后，使用糖過(guò)氧化物酶診斷試劑盒檢測(cè)血糖，快速血糖濃度大于250 mg/dl認(rèn)為糖尿病模型制作成功，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為10組，每組8只：(1)對(duì)照組(Con)；(2)模型組；(3)低劑量治療組〔OST (1)〕；(4)中劑量治療組〔OST (10)〕；(5)高劑量治療組〔OST(50)〕；(6)陽(yáng)性對(duì)照組(Don)；(7)低劑量OST聯(lián)合PI3K抑制劑組〔OST(1)+LY294002〕；(8)中劑量聯(lián)合PI3K抑制劑組〔OST(10)+LY294002〕；(9)高劑量聯(lián)合PI3K抑制劑組〔OST(50)+LY294002)〕；(10)模型給予PI3K抑制劑組。其中模型組中給予等量的生理鹽水作為對(duì)照，OST以腹腔注射方式分別按照1、10和50 mg/kg給藥，1次/d，連續(xù)給藥5 w;PI3K抑制劑LY294002在OST最后一次給藥時(shí)進(jìn)行腹腔注射，給藥濃度為50 mmol/L，多奈哌齊在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前21 d開(kāi)始腹腔注射給藥，1次/d，連續(xù)給藥21 d。各組動(dòng)物每周測(cè)體重和血糖。給藥結(jié)束后，進(jìn)行后續(xù)的水迷宮實(shí)驗(yàn)。

1.3水迷宮實(shí)驗(yàn)參照以前的實(shí)驗(yàn)方法采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)考察各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力〔7〕。實(shí)驗(yàn)周期共5 d。第1天將大鼠放入水中自由游泳2 min，水迷宮里未放平臺(tái)。第2～4天為定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的逃逸潛伏期(找到平臺(tái)所需的時(shí)間)。第5天為空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在60 s內(nèi)穿梭平臺(tái)的次數(shù)和于平臺(tái)所在象限內(nèi)(目標(biāo)象限)探索時(shí)間。

1.4AChE和ChAT活性測(cè)定水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在麻醉狀態(tài)下斷頭迅速剝離海馬，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的AChE和ChAT活性。

1.5炎癥因子的活性測(cè)定各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物剝離海馬后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)炎癥相關(guān)因子(NF-κB p65、TNF-α和IL-1β)的活性。

1.6Western印跡實(shí)驗(yàn)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于麻醉狀態(tài)下斷頭迅速剝離海馬，加入預(yù)冷的500 μl RIPA裂解液同時(shí)加入5 μl PMSF，超聲勻漿后低溫高速離心(4℃，12 000 r/min，20 min)，取上清后，BCA法進(jìn)行蛋白定量。按照50 μg蛋白的量進(jìn)行電泳(10% SDS-PAGE凝膠)，濃縮膠為120 V，分離膠為80 V。轉(zhuǎn)印至NC膜(200 mA，1.5 h)，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入p-Akt一抗(1∶300)或Akt一抗(1∶300)4℃孵育過(guò)夜，次日加入相應(yīng)的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，結(jié)果經(jīng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集，測(cè)定灰度值。

1.7caspase-3活性測(cè)定各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于麻醉狀態(tài)下斷頭迅速剝離海馬，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定caspase-3的活性。

2結(jié)果

2.1OST改善了糖尿病大鼠模型的體重和血糖給予OST治療5 w后，與Con組比較，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型體重明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。使用不同劑量的OST治療5 w后，這種體重減少的現(xiàn)象得到明顯逆轉(zhuǎn)(P<0.01)。與此同時(shí)，相比于Con組，糖尿病大鼠模型的血糖顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而OST顯著降低了糖尿病大鼠的血糖濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。OST改善糖尿病大鼠模型的體重和血糖的作用與陽(yáng)性對(duì)照藥多奈哌齊的作用非常相似。見(jiàn)表1。

表1　OST對(duì)糖尿病大鼠體重、血糖及空間探索實(shí)驗(yàn)的影響 ± s， n=8)

與Con組比較：1)P<0.01，與模型組比較：2)P<0.01，下表同

2.2OST改善了糖尿病大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力糖尿病大鼠模型在第1天至第4天實(shí)驗(yàn)中，逃逸潛伏期均比Con組明顯增加(P<0.01)；同時(shí)，在第5天的空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)，模型組中穿梭平臺(tái)的次數(shù)和在目標(biāo)象限中探索的時(shí)間均比Con組顯著縮短(P<0.01)。而使用不同劑量的OST(1，10和50 mg/kg)顯著減少了逃逸潛伏期，增加了穿梭次數(shù)和在目標(biāo)象限中探索的時(shí)間(P<0.01)，且50 mg/kg OST改善糖尿病大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶作用與陽(yáng)性對(duì)照藥多奈哌齊的作用非常相似。見(jiàn)圖1，表1。

圖1　OST對(duì)糖尿病大鼠模型逃逸潛伏期的影響

2.3OST改變了糖尿病大鼠模型海馬中AChE和ChAT的活性DM組AChE的活性顯著高于Con組(P<0.01)，而ChAT的活性卻顯著低于正常組(P<0.01)。不同劑量(1、10和50 mg/kg)OST干預(yù)后，海馬中AChE的活性顯著降低(P<0.01)，同時(shí)ChAT的活性顯著增高(P<0.01)，且50 mg/kg OST改變糖尿病大鼠模型海馬中AChE和ChAT活性的作用與陽(yáng)性對(duì)照藥多奈哌齊的作用非常相似。見(jiàn)表2。

表2　各組AchE及ChAT活性比較

2.4OST抑制了糖尿病大鼠模型海馬中炎癥因子的活性DM組炎癥因子(包括p65 of NFκB，TNF-α和IL-1β)的活性顯著高于Con組(P<0.01)。而使用不同劑量(1、10和50 mg/kg)的OST能夠顯著抑制DM組中炎癥因子的活性(P<0.01)，且這種抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照藥多奈哌齊的作用非常相似。此外，使用不同劑量的OST與LY294002聯(lián)合干預(yù)后，與單獨(dú)使用OST相比較，炎癥因子的活性進(jìn)一步降低(P<0.01)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，高劑量(50 mg/kg)OST與LY294002聯(lián)合干預(yù)后，抑制海馬中炎癥因子活性的作用最明顯(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3　各組炎癥相關(guān)因子水平比較 ± s, n=8)

與Con組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與Don組比較：3)P<0.01，下表同

2.5各組p-Akt相對(duì)表達(dá)量及caspase-3水平比較糖尿病模型大鼠海馬中p-Akt蛋白表達(dá)、caspase-3的活性顯著高于Con組(P<0.01)。不同劑量OST(1、10和50 mg/kg)顯著降低了DM組中p-Akt的蛋白表達(dá)，并抑制了caspase-3的活性(P<0.01)。且50 mg/kg OST對(duì)糖尿病大鼠模型海馬中p-Akt蛋白、caspase-3活性的改變與陽(yáng)性對(duì)照藥多奈哌齊的作用非常相似。使用不同劑量的OST與LY294002聯(lián)合干預(yù)后，與單獨(dú)使用OST干預(yù)相比較，p-Akt蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.01)；高劑量(50 mg/kg)OST與LY294002聯(lián)合干預(yù)后，降低海馬中p-Akt蛋白的表達(dá)最為明顯(P<0.01)。在所有實(shí)驗(yàn)組中，海馬中總Akt蛋白的表達(dá)沒(méi)有任何影響。見(jiàn)表4。

表4　各組p-Akt相對(duì)表達(dá)量及caspase-3水平比較

3討論

高血糖可能是糖尿病腦病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素〔6〕。因此，通過(guò)對(duì)血糖的控制，可能對(duì)于減輕糖尿病并發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙具有十分重要的意義。本研究表明OST具有降糖作用，能夠提高糖尿病大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力。OST能夠增強(qiáng)東莨菪堿引起的學(xué)習(xí)記憶障礙〔7〕。

以往有證據(jù)表明，膽堿能神經(jīng)元功能異常與糖尿病并發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)生密切相關(guān)，即膽堿能神經(jīng)元中乙酰膽堿含量的降低能夠促使糖尿病腦病的發(fā)生〔8〕。AChE和ChAT是膽堿能神經(jīng)元中兩種關(guān)鍵酶，其中AChE分解乙酰膽堿，降低乙酰膽堿的含量，而ChAT能夠合成乙酰膽堿，提高乙酰膽堿的含量，它們?cè)趯W(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。筆者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OST能夠顯著降低糖尿病大鼠模型海馬中AChE的活性，同時(shí)也可以顯著提高海馬中ChAT的含量。

炎癥因子在學(xué)習(xí)記憶障礙中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。大量研究表明，糖尿病腦病的大鼠模型中往往會(huì)釋放大量的炎癥因子〔9，10〕。有研究報(bào)道，NF-κB p65介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以促進(jìn)糖尿病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程〔11〕。筆者的研究結(jié)果表明，OST可以顯著抑制糖尿病大鼠模型海馬中的炎癥反應(yīng)。同時(shí)當(dāng)OST聯(lián)合PI3K的抑制劑LY294002時(shí)，OST抑制炎癥反應(yīng)的作用得到加強(qiáng)。OST還可提高糖尿病大鼠模型海馬中p-Akt蛋白的表達(dá)；而聯(lián)合PI3K的抑制劑LY294002時(shí)，蛇床子素的這種作用得到逆轉(zhuǎn)；提示OST抑制糖尿病腦病的炎癥反應(yīng)可能是通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。以往有研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路與炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔12～14〕，通過(guò)抑制PI3K/Akt通路可以顯著降低炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

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〔2015-02-17修回〕

(編輯曲莉)