許藝珊 許艷冰 許惠賢 蔣 倩

（福建師范大學生命科學學院，福建 福州350108）

1 實驗步驟

1.1 培養(yǎng)基母液的配制和保存

用電子天枰逐個稱取，依次倒入盛有一定蒸餾水的燒杯中，攪拌混勻溶解，定容至1L，保存在棕色試劑瓶中，貼好標簽，注明名稱和日期。

1.1.1 MS大量元素母液

1.7g KH2 PO4+3.7g MgSO4·7H2O+16.5gNH4·NO3+19g KNO3+4.4g CaCl2·2H2O。

1.1.2 MS微量元素母液

4.46g MnSO4·4H2O+1.72g ZnSO4·7H2O+1.24g H3BO3+0.166g KI+0.05g Na2MoO4·2H2O+0.005g CuSO4·5H2O+0.005g CoCl2·6H2O。

1.1.3 MS鐵鹽母液

7.46g Na2·EDTA+5.56g FeSO4·7H2O。

1.1.4 MS有機母液

0.1g甘氨酸+0.02g鹽酸硫胺素+0.025g鹽酸吡哆素+0.025g煙酸+5g肌醇。

1.2 MS培養(yǎng)基的配制

1.2.1 配制培養(yǎng)液

用量筒或移液管從各種母液中分別取出所需的用量于1L燒杯中，制備培養(yǎng)液：100mlMS大量元素母液+5mlMS微量元素母液+5mlMSMS鐵鹽母液+20mlMS有機母液。

1.2.2 溶化瓊脂與調(diào)pH

用天平分別稱取瓊脂7g、蔗糖30g，放入燒杯中，再加入蒸餾水750 mL，用微波爐加熱直到液體呈半透明狀。然后再將配好的混合培養(yǎng)液加入到煮沸的瓊脂中，再加入生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：0.5mg/L NAA+2mg/L 6-BA，最后加蒸餾水定容至1L，攪拌均勻。用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到6.2為止。

1.2.3 培養(yǎng)基的分裝

溶化的培養(yǎng)基趁熱分裝，瓶中培養(yǎng)基的量約為瓶容量的1/5～1/4，每瓶大約40~50ml，分裝23~30瓶即可，及時封蓋瓶口，貼上標簽。培養(yǎng)基配制完畢后，應立即滅菌。

1.3 實驗器皿等的清洗、包扎、滅菌

在組培瓶中加入100ml蒸餾水，準備5瓶，封口包扎；取槍狀鑷子、普通鑷子各1把、2把剪刀，用報紙和橡皮圈包扎好，作為誘導月季不定芽和愈傷組織的接種工具；培養(yǎng)基；2個500ml燒杯、3個培養(yǎng)皿（內(nèi)有濾紙）用報紙包扎。將以上材料一齊放入高壓滅菌鍋進行高壓滅菌。

1.4 外植體的滅菌消毒及接種

外植體先用肥皂水涮洗，再用流水沖洗干凈，放入滅菌的燒杯中。將培養(yǎng)基、無菌水、接種工具、酒精燈等置于接種臺，打開超凈工作臺紫外線開關(guān)，同時打開接種室內(nèi)的紫外燈，用紫外燈照射30min，然后關(guān)閉室內(nèi)的紫外燈，開送風開關(guān)，關(guān)閉臺內(nèi)的紫外燈，通風10min。再開日光燈進行無菌操作。

接種前用肥皂水洗手，并用酒精棉球擦拭雙手和臺面。將70%的酒精倒入外植體的燒杯中浸泡30s，再倒入0.1%HgCl浸泡10min，重復無菌水清洗5道。無菌濾紙吸干水分，將莖段和葉片放在裝有濾紙的培養(yǎng)皿上吸干水分。接種時莖基部朝下，將其1/3部分植入培養(yǎng)基；葉片應包含一部分中脈，將葉片平置于培養(yǎng)基上，下表面朝下，接觸培養(yǎng)基。

在培養(yǎng)瓶上寫上日期，移入培養(yǎng)室進行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度25度左右，光強1500~20000lx，光照時間14h/d。2周后觀察誘導情況。

2 結(jié)果與分析

外植體對愈傷組織狀態(tài)的影響：

經(jīng)過實驗觀察，發(fā)現(xiàn)兩種外植體經(jīng)過培養(yǎng)均誘導出愈傷組織，葉片和莖段愈傷組織形態(tài)上差異不明顯，愈傷組織多數(shù)呈淡黃色，松散程度不一，但葉片誘導率愈傷組織100%，比莖段稍高。

圖1 月季莖段誘導愈傷組織

圖2 月季葉片誘導愈傷組織

3 小結(jié)

葉片和嫩莖均可用于誘導愈傷組織。愈傷組織的形成與否和長勢好壞還受外植體材料、生長調(diào)節(jié)劑濃度、消毒等諸多因素的共同影響。其中，生長調(diào)節(jié)劑的種類、用量及配比對調(diào)控植物器官產(chǎn)生愈傷組織的作用，還有待進一步研究。月季生長繁殖速度較慢，應用組織培養(yǎng)技術(shù)可大大縮短它的增殖周期，必將帶來巨大的經(jīng)濟效益、社會效益。

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