董文賓， 王世鵬

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安　710021)

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微波法輔提靈芝多糖及體外抗氧化研究

董文賓， 王世鵬

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安710021)

摘要：本實驗采用單因素及正交試驗對微波法輔提靈芝多糖提取工藝條件進行優(yōu)化，以抗壞血酸為陽性對照對靈芝粗多糖體外抗氧化活性進行評價.實驗結(jié)果顯示靈芝經(jīng)蒸餾水預浸泡1 h后在溫度60 ℃、料水比1∶40、微波功率100 W、微波時間30 min的提取條件下多糖得率最高.靈芝粗多糖體外抗氧化活性試驗證明靈芝粗多糖有一定的體外抗氧化活性且與濃度呈正相關(guān)，但總體不及抗壞血酸.當靈芝多糖濃度為2 mg/mL時，對·OH和O2-·的清除能力最大分別為62.07%和 55.39%，說明其對活性氧自由基的清除具有選擇性，可能與其粗多糖中的雜質(zhì)、多糖結(jié)構(gòu)和清除機理有關(guān).

關(guān)鍵詞：靈芝多糖； 微波法； 體外抗氧化

0引言

靈芝(Ganoderma Lucidum)又稱為靈芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株，寄生于櫟及其它闊葉樹根部的多孔菌科真菌[1].現(xiàn)代藥理學研究[2-5]證實靈芝具有增強機體免疫，提高機體耐缺氧能力，抑制腫瘤，保肝護肝清除自由基以延緩衰老等多方面的藥理活性.本實驗所用靈芝孢子粉經(jīng)鑒定為赤芝，靈芝多糖含量為2.2%～2.6%.

靈芝多糖因可溶于水，目前多采用水、稀堿、稀酸以及二甲基亞砜作為溶劑提取靈芝多糖[6-8].水浸提法多糖得率低且耗時長，采用稀酸、稀堿浸提時可提升多糖得率,但對多糖的組織結(jié)構(gòu)損害較大，采用二甲基亞砜作為浸提溶劑時二甲基亞砜價格昂貴且對人體有害,在實際應用中阻力較大[9].研究顯示采用微波法提取靈芝多糖具有得率高，對多糖組織結(jié)構(gòu)損傷小、操作簡便等優(yōu)點[10,11].本實驗通過單因素及正交試驗進一步優(yōu)化微波法提取多糖工藝.

靈芝多糖是靈芝中的一種重要的活性成分，逐漸成為研究熱點，本實驗通過檢測靈芝多糖的體外抗氧化活性，以期對靈芝多糖的藥用和保健價值做出判斷，并促進靈芝多糖產(chǎn)品進一步開發(fā).

1材料與方法

1.1實驗材料與試劑

(1)材料：靈芝孢子粉購于山西農(nóng)業(yè)大學食用菌中心，該靈芝經(jīng)鑒定為赤芝.

(2)試劑：丙酮、濃硫酸、L-抗壞血酸、30%雙氧水(H2O2)、水楊酸、Tris、鄰苯三酚、三氯乙酸、硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)、亞硝酸鈉(NaNO2)、鹽酸-α-奈胺、對氨基苯磺酸，試劑均為分析純.

1.2實驗儀器設(shè)備

TDA-8002-電熱恒溫水浴鍋(北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司)；BS224S-電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；WFJ2100型-可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)；TDL-4-臺式離心機(上海安亭科學儀器廠制造)；DHG-9243BS-Ⅲ-電熱恒溫鼓風干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；SHB-3-真空抽濾機(鄭州長城科工貿(mào)有限公司).

1.3實驗方法

1.3.1靈芝多糖的制備工藝

靈芝孢子粉→蒸餾水浸泡→微波預處理→離心取上清液→乙醇沉淀→靈芝多糖.

1.3.2靈芝多糖的工藝優(yōu)化

(1)提取方法單因素試驗

考察微波功率、溫度、料水比、微波時間對微波法提取靈芝粗多糖得率的影響.

(2)提取方法正交試驗

根據(jù)單因素試驗，通過L934正交試驗選擇浸提溫度、料水比、微波功率、微波對微波法提取靈芝粗多糖進行條件優(yōu)化.

1.3.3靈芝多糖得率的測定

本實驗根據(jù)《中國藥典》規(guī)定的靈芝多糖硫酸蒽酮比色法檢測靈芝多糖得率，具體采用90%硫酸-蒽酮法水浴10 min測定多糖提取率[12].

1.3.4靈芝粗多糖的抗氧化活性研究

(1)粗多糖對羥基自由基(·OH)清除能力的研究

將粗多糖用蒸餾水溶解，配成2 mg/mL溶液，并進行梯度稀釋.在試管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，待測樣液2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置10 min，然后加入6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，搖勻，放入37 ℃水浴鍋中加熱30 min后取出，待到室溫后于510 nm處測其吸光度(Ai)；另取2支試管，分別做空白(Ac)和樣品對照(Aj).以Vc做為陽性對照，測定在相同條件下對·OH的清除能力進行測定.按下式計算各待測樣品對羥自由基(·OH)的清除率[13].

羥基自由基(·OH)清除率(%)=

式中：Ai—表示樣液與水楊酸溶液混合液的吸光值；Aj—表示樣液與空白溶劑混合液的吸光值；Ac—表示水楊酸溶液與空白溶劑混合液的吸光值.

(2)粗多糖對超氧陰離子(O2-·)自由基清除能力的研究

將粗多糖用蒸餾水溶解，配成2 mg/mL溶液，并進行梯度稀釋.取試樣100μL，0.1 mol/L的Tris-HCl 1.8 mL和蒸餾水1.0 mL，放入同一試管中，25 ℃水浴保溫10 min，加入同樣溫浴的3 mmol/L的鄰苯三酚100μL，迅速混合，然后每隔30 s測定在325 nm處的吸光值，記為A樣本.以10 mmol/L的HCl溶液配制空白管作為對照，記為A對照.得出A325隨時間變化的曲線，重復三次，取平均值.以Vc作為陽性對照，進行相應的測定.按照下列公式計算待測樣品對超氧陰離子自由基的清除能力[14-16].

(3)粗多糖還原能力的研究

將粗多糖用蒸餾水溶解，配成2 mg/mL溶液，并作梯度稀釋.取0.5 mL不同濃度的樣品，加入1.25 mL磷酸緩沖液(PBS，pH=6.6，0.2 mol/L)和1.25 mL 1%(w/v)K3Fe(CN)6，在50 ℃下反應20 min，而后加入1.25 mL的三氯乙酸(10%，w/v)，在6 000 r/min下離心10 min，取上清夜3.0 mL與0.30 mL所配的FeCl3(0.1%，w/v)混合搖勻后，在700 nm處測定溶液的吸光度，重復以上操作3次,取平均值[14,15,17].以Vc做為陽性對照，測定其總還原力.

2結(jié)果與討論

2.1微波法提取靈芝粗多糖的條件優(yōu)化

2.1.1微波功率對靈芝粗多糖得率的影響

在溫度50 ℃，料水比為1∶30，超聲時間20 min,考察微波功率分別為0 W、100 W、300 W、500 W、700 W時對靈芝粗多糖得率的影響，結(jié)果如表1所示.

表1　微波功率對靈芝粗多糖得率的影響

從表1可看出，隨著微波功率的增加，靈芝多糖的得率也隨之增大，當微波功率達到500 W時多糖提取率最高，但當微波功率為700 W時多糖得率反而降低，這可能是微波功率過高使靈芝多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，說明微波功率對多糖得率有較大影響，最佳的微波功率條件是500 W.

2.1.2溫度對靈芝粗多糖得率的影響

在微波功率為500 W，料水比為1∶30，超聲時間20 min條件下, 考察溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃時對靈芝粗多糖得率的影響，結(jié)果如表2所示.

表2　溫度對靈芝粗多糖得率的影響

從表2可看出，隨溫度升高，多糖分子移動加快利于溶出，當溫度為60 ℃時多糖得率最高，但當溫度為70 ℃時，可能由于溫度過高對多糖組織結(jié)構(gòu)造成破壞影響多糖的提取.

2.1.3料液比對靈芝粗多糖得率的影響

在溫度60 ℃，微波功率為500 W，超聲時間20 min，考察料水比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50對靈芝粗多糖得率的影響，結(jié)果如表3所示.

表3　料水比對靈芝粗多糖得率的影響

從表3可看出，隨著加水量的增大多糖越易溶出，但加水量過高會使?jié)饪s程序更加繁瑣.當料水比為1∶40時多糖得率最高.

2.1.4微波時間比對靈芝粗多糖得率的影響

在溫度50 ℃，料水比為1∶40，微波功率為500 W，考察超聲時間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min對靈芝粗多糖得率的影響，結(jié)果如表4所示.

表4　微波時間比對靈芝粗多糖得率的影響

從表4可看出，微波時間為30 min時多糖得率最高，之后隨時間的延長多糖得率下降，時間的延長會對靈芝組織產(chǎn)生破壞利于多糖提取、但多糖結(jié)構(gòu)也會發(fā)生變化.

2.2正交試驗確定微波法提取靈芝粗多糖的最佳條件

通過單因素試驗每個因素選擇三個水平進行正交試驗，結(jié)果如表5所示.

表5　微波法提取靈芝多糖正交試驗結(jié)果

由表5可看出，微波法提取靈芝粗多糖的影響因素從小到大依次為D

2.3靈芝粗多糖的抗氧化活性測定

2.3.1靈芝粗多糖對·OH自由基的清除能力測定

靈芝粗多糖對·OH自由基的清除能力測定結(jié)果見圖1所示.

圖1　靈芝粗多糖對·OH自由基的清除能力測定

·OH一直被認為是毒性最強的活性氧自由基，是造成人體有機體過氧化損傷的主要因素，因此，對于清除·OH對人體的健康有非常重要的作用.由圖1可以看出，雖然靈芝多糖對其有一定的清除能力，且隨著濃度的增大清除率越來越大，增長速率也越來越快，但總體來說清除能力較弱.在試驗范圍內(nèi)，靈芝粗多糖對·OH的清除能力最大為62.07%，而在與陽性對照Vc對比可知，其開始清除率增長速率較快，但隨著濃度增大增長緩慢，在試驗范圍內(nèi)最大清除率為79.76%，因此，同濃度下靈芝粗多糖對·OH清除能力較弱.

2.3.2靈芝粗多糖對O2-·自由基的清除能力測定

靈芝粗多糖對O2-·自由基的清除能力結(jié)果見圖2所示.

圖2　靈芝粗多糖對O2-·自由基的清除能力測定

O2-·在人體中含量過多會引起機體細胞結(jié)構(gòu)與功能的損傷.不同濃度的靈芝粗多糖溶液加入到O2-·發(fā)生體系后，如圖2所示，隨著濃度的增大，清除率增長緩慢，濃度最大時清除率達到55.39%.與陽性對照Vc比較，Vc在試驗條件下，當濃度較小時，清除率增長較慢，當濃度大于0.5 mg/mL時清除率增長較快，清除率較高，最大能達到69.05%.可見，同等濃度下，靈芝粗多糖溶液對O2-·的清除能力很弱，與Vc相差較大.

2.4粗多糖的還原能力的測定

粗多糖的還原能力測定結(jié)果見圖3所示.

圖3　靈芝粗多糖的還原能力測定

物質(zhì)的還原能力可以反映其潛在的抗氧化活性，具有較好還原能力的物質(zhì)通常是電子供體，能夠清除脂質(zhì)過氧化過程中的中間產(chǎn)物.由圖3可看出，靈芝粗多糖的總的還原力一般，隨著濃度的增大，總還原力增大，且增大速率越來越快.與陽性對照Vc相比可知，在試驗范圍內(nèi)，靈芝粗多糖的還原能力與Vc的還原能力增長率相似，且總的還原力相差不大.

3結(jié)論

(1)通過單因素和正交試驗對微波法提取靈芝粗多糖的工藝條件進行優(yōu)化，結(jié)果為在溫度60 ℃、料水比1∶40、微波功率100 W、微波時間30 min的條件下對靈芝進行預處理后，多糖提取率最高.

(2)實驗中體外抗氧化活性試驗結(jié)果顯示，靈芝粗多糖對·OH的清除能力最大為62.07%，對O2-·清除能力可達到55.39%.

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Research in auxiliary mention and antioxidant in vitro

of ganoderma lucidum polysaccharides

DONG Wen-bin， WANG Shi-peng

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:In this paper,single factor and orthogonal experiments were designed to optimize the microwave extraction conditions of ganoderma lucidum polysaccharides from the aspects of temperature,material-water ratio,microwave power,microwave extraction time in this paper.Results showed that after pre-soaking in distilled water for an hour,when the temperature,material-water ratio,microwave power and microwave extraction time was respectively 60 ℃,1∶40,100 W,30 min,the obtaining rate of polysaccharides was the highest.It proved that ganoderma crude polysaccharides had some reducing ability and scavenging capacity of different radicals,which meant it had a certain selectivity of scavenging free radical.It might be related to impurities in the crude polysaccharides,polysaccharide structure and scavenging mechanisms.

Key words:ganoderma lucidum polysaceharide； microwave extraction； antioxidant

中圖分類號：S646.19

文獻標志碼：A

文章編號：1000-5811(2015)05-0115-05

作者簡介:董文賓(1951-)，男，陜西寶雞人，教授，博士生導師，研究方向：功能食品

基金項目：陜西省科技廳科技計劃項目(2013KTZB02-01-04)

收稿日期:*2015-07-21