賈玉峰

252600山東省臨清市人民醫(yī)院腫瘤科

微血管密度對食管鱗狀細胞癌預(yù)后的價值

賈玉峰

252600山東省臨清市人民醫(yī)院腫瘤科

目的：研究食管鱗狀細胞癌組織中CD105標(biāo)記的微血管密度(MVD)的預(yù)后價值。方法：收治原發(fā)性食管鱗癌初治患者50例，給予根治性切除術(shù)。所有標(biāo)本預(yù)處理后，均采用SP免疫組織化學(xué)染色法檢測MVD，并隨訪生存時間。分析其與食管鱗癌臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果：食管鱗癌組織中CD105標(biāo)記的MVD值與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期呈正相關(guān)(P＜0.05)。Kaplan-meier生存分析及COX回歸均顯示MVD是影響食管鱗癌預(yù)后的獨立因素。結(jié)論：CD105標(biāo)記的MVD反映食管鱗癌患者的血管生成情況，與腫瘤生長及轉(zhuǎn)移相關(guān)。高MVD者預(yù)后不良，是影響其預(yù)后的獨立因素。

食管鱗狀細胞癌；免疫組織化學(xué)；CD 105；微血管密度；預(yù)后

血管形成對于惡性腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)均有重要作用。檢測腫瘤組織內(nèi)的血管形成有助于判斷復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險并評估預(yù)后。食管癌是我國的高發(fā)腫瘤，就診時多為中晚期，療效較差。選擇合適的預(yù)后評估指標(biāo)，對于了解其惡性程度、選擇個性化治療方案有重要的臨床意義。但目前對于食管癌患者的預(yù)后指標(biāo)仍無定論。本研究檢測了食管鱗癌組織中CD105標(biāo)記的微血管密度(Microvessel density，MVD)，并探討其與臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

2008年1月-2009年1月收治行根治性手術(shù)切除的原發(fā)性食管鱗狀細胞癌初治患者50例，男35例，女15例，年齡42～74歲，平均57.3歲。術(shù)后病理均為鱗癌，其中高分化19例，中分化24例，低分化7例。按照2009UICC食管癌國際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[1]，T1 4例，T2 12例，T3 31例，T4 3例；N0 11例，N1 19例，N2 16例，N3 4例；M0 50例；Ⅰ期6例，Ⅱ期29例，Ⅲ期19例，無Ⅳ期。胸上段9例，胸中段28例，胸下段13例。50例患者的一般特點，見表1。

試劑：第一抗體CD105為鼠抗人單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBSPH 7.4)、3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑、多聚-L-賴氨酸、檸檬酸緩沖液均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

SP免疫組化方法：按照產(chǎn)品說明書進行。石蠟組織切片常規(guī)脫蠟，水化；過氧化氫甲醇阻斷過氧化物酶，CD105標(biāo)記的MVD用檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法修復(fù)。滴加羊非免疫血清，室溫下孵育10min。復(fù)溫后滴加二抗，37℃孵育10min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封固和觀察。PBS為陰性對照，已知的陽性標(biāo)本為陽性對照。

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：CD105表達在血管內(nèi)皮細胞的細胞膜上，對具有增殖活性的細胞進行標(biāo)記。MVD計數(shù)用Weidner 法[2]，任何呈現(xiàn)棕黃色的內(nèi)皮細胞或細胞簇與鄰近血管其他結(jié)締組織成分清楚區(qū)別為1個微血管。首先在低倍鏡下掃描，尋找清楚的血管且微血管數(shù)最多的區(qū)域染色，然后在高倍鏡觀察5個視野，記錄微血管數(shù)，其平均值即為MVD。

隨訪：對所有患者治療后進行隨訪，主要通過電話或信件的方式。

統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，定性資料用χ2檢驗、Fisher精確概率檢驗、非參數(shù)檢驗及Spearman等級相關(guān)分析，MVD以±s)表示，定量資料組間比較用成組t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，生存分析用Cox回歸分析，檢驗水準(zhǔn)取α=0.05(雙尾)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

CD105標(biāo)記的MVD與食管鱗癌臨床病理因素之間的關(guān)系：CD105免疫染色定位于內(nèi)皮細胞，鏡下顯示癌組織中的微血管形態(tài)不規(guī)則，呈現(xiàn)不均勻的分布，微血管數(shù)最多的區(qū)域位于癌巢邊緣近間質(zhì)，大多數(shù)形態(tài)為簇狀，部分呈條索狀，見圖1。

圖1　CD105標(biāo)記的血管內(nèi)皮細胞

MVD與患者性別、年齡及原發(fā)灶部位、病灶長度、分化程度、食管鋇餐分型之間無相關(guān)性(P＞0.05)，但與T分期(rs=2.472，P=0.017)、N分期(rs=2.386，P=0.021)、TNM分期(rs=2.351，P=0.023)明顯相關(guān)。癌組織侵達食管外膜及鄰近組織者(T3～T4組)的MVD明顯高于僅侵達黏膜固有層、黏膜下層或肌層者(T1～T2組)(t=2.472，P=0.017)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者(21.47±5.19)明顯高于陰性者(15.27±5.25)(t=2.386，P=0.021)；Ⅲ期者明顯高于Ⅰ～Ⅱ期者(t=2.351，P= 0.023)，見表1。

表1　CD105標(biāo)記的MVD與食管癌臨床病理因素之間的關(guān)系(±s)

表1　CD105標(biāo)記的MVD與食管癌臨床病理因素之間的關(guān)系(±s)

注：?單因素方差分析，其余均為成組t檢驗。

項目　MVD　r P性別　　男　20.66±8.58　1.790　0.08 女16.49±6.49年齡(歲)　　≤55　20.23±7.93　0.72　0.475 ＞55　18.65±7.58部位　　胸上段　21.26±6.04　F=0.875?　0.259胸中段　22.34±6.78胸下段　20.31±5.97最大徑(cm)　　≤3　16.23±5.83　2.506　0.056 ＞3　21.53±8.16大體分型　　髓質(zhì)型　18.36±6.42　F=0.682?　0.213蕈傘型　17.62±6.03潰瘍型　18.26±7.51縮窄型　17.58±5.98分化程度　　高分化　19.37±7.52　F=0.056?　0.912中分化　19.28±6.30低分化　17.46±5.97 T分期　T1～T2　15.98±5.36　2.472　0.017 T3～T4　21.33±8.22 N分期　N 0　15.27±3.25　2.386　0.021 N 1　18.28±8.41 N 2　21.01±7.23 N 3　23.29±2.48 TNM分期　?、瘛颉?7.23±6.06　2.351　0.023 Ⅲ22.18±8.79

生存分析結(jié)果表明，MVD與總生存時間(OS)呈明顯相關(guān)(P＜0.005)，高MVD者提示預(yù)后不良，見圖2。

圖2　MVD與總生存率的K-M分析

OS的單因素回歸分析：在影響患者OS的多種單因素中，MVD(P=0.006， OR=1.063，95%CI 1.032～1.105)呈顯著正相關(guān)。腫瘤T分期(P=0.032，OR= 7.146，95%CI2.826～18.070)、N分期(P= 0.047，OR=1.060，95%CI 1.017～7.105) 及TNM分期(P=0.048，OR=5.431，95% CI 2.526～12.071)均與OS呈正相關(guān)。腫瘤分期晚及高MVD是食管鱗癌的危險預(yù)后因素，見表2。

表2　影響食管鱗癌患者OS的單因素Cox分析

OS的多因素回歸分析：多因素回歸分析表明，T分期(P=0.043，OR=2.512，95%CI 0.688～9.174)、N分期(P=0.048，OR=2.477，95%CI 1.492～12.486)、TNM分期(P=0.050，OR=1.379，95%CI 2.368～5.160)及MVD(P=0.036， OR= 1.226，95%CI0.798～6.437)均與OS呈顯著正相關(guān)。腫瘤分期晚及高MVD是食管鱗癌的危險預(yù)后因素，見表3。

討論

新生血管形成是腫瘤賴以生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的病理組織學(xué)基礎(chǔ)，受多種促血管生成因子和抗血管生成因子的復(fù)雜調(diào)節(jié)。雖然目前尚不清楚其確切機制，但認為其機制是新生血管基底膜不完整，通透性大，腫瘤細胞容易漏過。同時，內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的多種基質(zhì)降解酶，增加了瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[3]。在新生血管形成過程中，瘤組織內(nèi)的MVD最能代表血管新生的強度和活躍程度[4]。Folkman提出假說認為，新生血管為癌細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，如果沒有新生血管形成，腫瘤體積不會大于2～3mm3。新生血管形成前，通過彌散作用，為癌細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，血管形成后則變?yōu)楣嘧⒆饔?，因此，癌細胞呈指?shù)生長。腫瘤無限制的增長，需要生產(chǎn)大量的新生血管。此外，新生血管還是癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移的第一站，新生血管越豐富，癌細胞越容易血行轉(zhuǎn)移。因此，新生血管的形成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的作用。

表3　影響患者總生存時間的多因素回歸分析

新生微血管為瘤體增加能量供應(yīng)，即微血管為腫瘤的快速、無限制增長提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[5]。已有大量研究表明，MVD是惡性腫瘤的重要預(yù)后因素，隨著MVD升高，總生存期及無進展生存期降低[6-8]。與其他血管抗體相比，CD105單克隆抗體更具有特異性，它僅標(biāo)記癌組織內(nèi)新增生的微小血管，而不標(biāo)記已成熟的較大血管[9]。Rau等對比研究了乳腺癌患者CD105標(biāo)記的MVD和CD34標(biāo)記的MVD，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者與總生存期、無進展生存期呈顯著相關(guān)，但后者無相關(guān)性，多因素分析顯示CD105標(biāo)記的MVD是獨立的預(yù)后因素[10]。Hardavella等在非小細胞肺癌研究中得出，CD105標(biāo)記的MVD較低者可獲得相對較長的生存期，提示新生的腫瘤微血管在其生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，是影響腫瘤預(yù)后的獨立因素[11]。劉宏斌等研究了80例食管鱗癌、10例正常食管組織中CD105標(biāo)記的MVD、cyclinD1的表達，發(fā)現(xiàn)二者是影響食管鱗癌預(yù)后的主要因素，且有獨立的預(yù)后意義[12]。在本研究中，MVD與性別、年齡、病變部位、原發(fā)病灶長度、分化程度、食管鋇餐分型無關(guān)(P＞0.05)，但與T分期、N分期及TNM分期明顯正相關(guān)。腫瘤侵達食管外膜及鄰近器官者(T3～T4)MVD明顯高于僅侵及黏膜固有層、黏膜下層或肌層者(T1～T2)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者明顯高于陰性者，TNM分期為Ⅲ期的MVD亦明顯高于Ⅰ～Ⅱ期。生存分析結(jié)果表明，CD105標(biāo)的MVD與OS顯著正相關(guān)，高MVD提示預(yù)后不良。MVD的表達與食管癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈顯著性相關(guān)，高MVD水平患者較低MVD水平患者預(yù)后差，進一步說明MVD表達水平升高在促進食管癌的進展中起重要作用。多因素分析表明MVD是食管鱗狀細胞癌患者可靠的預(yù)后指標(biāo)，這與其他學(xué)者的結(jié)論一致[13-14]。

Kaplan-meier生存分析顯示，MVD與總生存時間顯著相關(guān)。另外，腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均與總生存時間相關(guān)。腫瘤分期較晚及高水平MVD是食管鱗狀細胞癌的預(yù)后危險因素。COX回歸分析顯示相似結(jié)果，T分期、N分期、TNM分期及MVD均與總生存時間顯著相關(guān)。腫瘤分期較晚及高水平MVD是食管鱗狀細胞癌預(yù)后危險因素，這與Sakurai等的研究結(jié)論一致[15]。

總之，MVD作為一種食管鱗癌的預(yù)后指標(biāo)，越來越受到臨床重視，它對于食管鱗癌的診斷、療效評估、檢測復(fù)發(fā)、判斷預(yù)后，均有一定參考價值。

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Value of microvessel density on the prognosis of esophageal squamous cell carcinoma

Jia Yufeng
Department of Oncology,Linqing City People's Hospital of Shandong Province 252600

Objective:To study the prognostic value of microvascular density(MVD)labeled by CD105 in the esophageal squamous cell carcinoma tissues.Methods:50 untreated patients with primary esophageal squamous carcinoma were selected.They were given curative resection.After all the samples were pretreated,they were given SP immunohistochemistry to detect MVD,and the survival time was followed up.The relationship between MVD and the clinical pathological features and prognosis of esophageal squamous cell carcinoma was analyzed.Results:The value of MVD labeled by CD105 in the esophageal squamous cell carcinoma tissues was positively correlated with the depth of tumor invasion，lymph node metastasis and clinical TNM stage(P＜0.05).Kaplan-meier survival analysis and COX regression showed that MVD was an independent factor for affecting the prognosis of esophageal squamous carcinoma.Conclusion:MVD labeled by CD105 can reflect angiogenesis of patients with esophageal squamous carcinoma.It has the relation with tumor growth and metastasis.High MVD indicates a poor prognosis,and it is an independent factor for affecting the prognosis.

Esophageal squamous cell carcinoma;Immunohistochemistry;CD105;Microvessel density;Prognosis

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.31.51