腦出血患者外周血干擾素-γ、細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3 mRNA表達及意義

畢勝劉群1范佳2李冬王李鳴趙巖巖關(guān)雪蓮侯麗淳田嘉瑩王增冕李曉濤李培育

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002)

摘要〔〕目的探討腦出血患者外周血干擾素(IFN)-γ、細胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3的表達及意義。方法96例腦出血患者均為發(fā)病6 h內(nèi)來診，按發(fā)病距采血時間分為≤6 h組、>6 h且≤24 h組、>24 h且≤72 h組和>72 h組。另選24例正常人為對照組。檢測各組IFN-γ的水平及外周血中單個核細胞TIM-3 mRNA的表達。結(jié)果各實驗組IFN-γ的表達與對照組均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。>24 h且≤72 h組IFN-γ的表達顯著高于其他實驗組(P<0.05)。各實驗組TIM-3 mRNA的表達與對照組均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。>24 h且≤72 h組TIM-3 mRNA的表達顯著高于其他實驗組(P<0.05)。結(jié)論腦出血患者發(fā)病6 h內(nèi)，IFN-γ、TIM-3的表達增加，IFN-γ和TIM-3 參與腦出血后的病理過程。

關(guān)鍵詞〔〕腦出血;干擾素(IFN)-γ；細胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3

中圖分類號〔〕R743.34〔

基金項目：黑龍江省自然科學

通訊作者：李培育(1980-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腦血管病的發(fā)病機制研究。

1吉林大學白求恩第一醫(yī)院2吉林大學白求恩第二醫(yī)院

第一作者：畢勝(1981-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事腦血管病的發(fā)病機制研究。

腦出血約占全部腦血管疾病發(fā)病的30%，在我國表現(xiàn)為北方發(fā)病率高于南方的趨勢。已有研究〔1〕發(fā)現(xiàn)T細胞及其分泌的細胞因子亦參與腦出血后的炎癥反應(yīng)。CD4+T 細胞按照分化和功能特征分成Th1細胞，Tp細胞，Treg細胞、Th17細胞。干擾素(IFN)-γ 是Th1細胞的特征性細胞因子，廣泛參與Th1細胞的多種活動。細胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3是表達于Th1細胞、Th17細胞等多種細胞表面的分子。TIM-3 mRNA與缺血再灌注損傷等多種機制相關(guān)〔2,3〕。本研究通過檢測IFN-γ、TIM-3mRNA的表達，探究其在腦出血發(fā)病中的意義。

1材料與方法

1.1主要試劑人IFN-γ ELISA 檢測試劑盒，美國R&D公司；RT-PCR試劑盒，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；PCR引物，上海生工生物工程有限公司；Trizol試劑，大連寶生物工程有限公司。

1.2實驗分組2013年1月至2014年12月我院神經(jīng)內(nèi)科收治的腦出血患者96例，均符合診斷標準〔4〕，均為發(fā)病6 h內(nèi)來診。按發(fā)病距采血時間分為4組，分別為≤6 h組、>6 h且≤24 h組、>24 h且≤72 h組和>72 h組，每組24例。另選取體檢中心24例正常人作為對照組。所有病例均腦血管疾病家族史，無肝腎疾病、血液系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、自身免疫病、感染性疾病。

1.3取材抽取肘靜脈血2 ml，置于抗凝管中，采血1 h內(nèi)用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMC)；另取2 ml裝于試管內(nèi)，靜置30 min，以2 000 r/min離心15 min分離血清，分裝-80℃冰箱凍存。對照組取材方法同前。

1.4IFN-γ和TIM-3 mRNA檢測ELISA 法檢測IFN-γ 的水平。RT-PCR 法檢測TIM-3 mRNA 水平。內(nèi)參基因 β-actin(299 bp)的引物序列為：上游 5'-CCTGGACTTCGAGCAAGA-3'，下游 5'-GGGCAGTGATCTCCTTCT-3'；目的基因 TIM-3(558 bp)的引物序列為：上游 5'-CCAAAT CCCAGGCATAAT-3'，下游 5'-AAGCGACAACCCAAAGGT-3'；PCR 的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，反應(yīng)最后是72℃延伸5 min，總共30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物跑1.5%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，20 min)，凝膠成像系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1各組血清IFN-γ水平的比較各實驗組血清中 IFN-γ水平與對照組相比顯著增加(P<0.05)。>24 h且≤72 h組血清中IFN-γ的水平顯著高于其他各實驗組(P<0.05)。見表1。

2.2各組 PBMC 中 TIM-3 mRNA 的表達各實驗組PBMC中TIM-3 mRNA的表達與對照組相比顯著增加(P<0.05)。>24 h且≤72 h 組PBMC中TIM-3 mRNA的表達顯著高于其他各實驗組(P<0.05)。見表1。

表1　各組血清IFN-γ水平和PBMC中TIM-3 mRNA表達

與對照組比較：1)P<0.05；與≤6 h組比較：2)P<0.05；與>6 h且≤24 h組比較：3)P<0.05；與>24 h且≤72 h組比較：4)P<0.05

3討論

腦出血后機體發(fā)生一系列復(fù)雜的病理生理過程，研究證實炎癥反應(yīng)在腦出血發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本實驗提示IFN-γ、TIM-3 參與腦出血后的病理過程。IFN-γ主要是由Th1細胞分泌的細胞因子，主要參與細胞免疫。在對自身免疫性腦脊髓膜炎等多種炎癥性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，IFN-γ參與其發(fā)病的病理過程，并且能夠加劇中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織損傷〔5,6〕。本實驗提示腦出血早期，Th1細胞被動員活化，分泌IFN-γ，參與炎癥反應(yīng)等病理過程。

TIMs家族是一類重要的跨膜糖蛋白，TIM-3是其中重要的一種成員，表達于Th1、Th17細胞等多種細胞表面，在適應(yīng)性免疫及天然免疫中均發(fā)揮重要作用。TIM-3與其配體半乳凝素-9結(jié)合，能負性調(diào)節(jié)Th1細胞，減弱Th1應(yīng)答，誘導Th1細胞凋亡。半乳凝素-9在體內(nèi)能抑制幼稚的T細胞向Th17細胞分化。研究人員在對腦缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，TIM-3 參與腦的缺血再損傷，患者外周血中IL-17的水平與其CD4+T細胞表達的TIM-3具有明確的相關(guān)性〔2〕。本實驗提示腦出血早期，TIM-3參與腦出血早期的病理過程。已有研究證實，腦出血早期外周血中IL-17表達增加〔7〕，提示TIM-3可能通過多種調(diào)控機制，參與腦出血后多種細胞因子的表達，共同參與腦出血后的炎癥反應(yīng)，其具體機制有待于進一步研究。

4參考文獻

1林杰，張軍，張國華.腦出血血腫周圍組織損傷的炎癥反應(yīng)機制〔J〕.國外醫(yī)學·腦血管疾病分冊，2004；12(7)：517-9.

2Zhao D,Hou N,Cui M,etal. Increased T cell immunoglobulin and mucin domain 3 positively correlate with systemic IL-17 and TNF-α level in the acute phase of ischemic stroke 〔J〕. J Clin Immunol, 2011；31(4):719-27.

3Li HL, Kostulas N, Huang YM,etal. IL-17 and IFN-γ mRNA expression is increased in the brain and systemically after permanent middle cerebral artery occlusion in the rat 〔J〕. J Neuroimmunol, 2001；116(1): 5-14.

4王新德.各類腦血管疾病診斷要點 〔J〕.中華神經(jīng)科雜志,1996；29(6):379.

5Lambertsen KL, Gregersen R, Meldgaard M,etal. A role for interferon-gamma in focal cerebral ischemia in mice 〔J〕. J Neuropathol Exp Neurol,2004；63(9):942-55.

6Kim IJ, Beck HN, Lein PJ,etal. Interferon gamma induces ret rograde dendritic retraction and inhibits synapse formation 〔J〕. J Neurosci, 2002；22(11):4530-9.

7畢勝,范佳,陳光, 等.腦出血患者外周血IL-17，IL-23的表達及意義 〔J〕. 中國老年學雜志,2014；34(15):4135-6.

〔2014-12-19修回〕

(編輯苑云杰)