辣椒素通過(guò)調(diào)節(jié)PLC-γ1信號(hào)通路對(duì)膽管癌細(xì)胞功能的影響

江愷

(浙江省人民醫(yī)院普外科，浙江杭州310014)

摘要〔〕目的探討辣椒素(CAP)對(duì)人膽管癌(CCA)細(xì)胞系RBE增殖及凋亡的影響。方法體外培養(yǎng)的RBE細(xì)胞采用0、50、100、150、200 μmol/L的CAP及200 μmol/L的CAP處理0、24、48、72 h，用MTT方法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)RBE細(xì)胞增殖和凋亡能力的變化，采用Western印跡方法檢測(cè)RBE細(xì)胞中磷脂酶C(PLC)-γ1信號(hào)通路的磷酸化活化情況。采用PLC-γ1信號(hào)通路抑制劑U71322阻斷RBE細(xì)胞中PLC-γ1信號(hào)通路后，再以CAP處理RBE細(xì)胞，MTT方法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)RBE細(xì)胞增殖和凋亡能力的變化情況。結(jié)果與0 μmol/L CAP處理組相比，50、100、150、200 μmol/L的CAP可顯著抑制RBE細(xì)胞的增殖能力(P<0.01)，并增加RBE細(xì)胞的凋亡水平(P<0.01)，且這種作用具有劑量依賴性。Western印跡結(jié)果顯示，CAP顯著活化RBE細(xì)胞中的PLC-γ1信號(hào)通路，且隨著CAP處理濃度的升高，PLC-γ1信號(hào)通路活化水平逐漸升高。U71322阻斷RBE細(xì)胞中的PLC-γ1信號(hào)通路后，CAP抑制RBE細(xì)胞的增殖能力顯著降低(P<0.01)。結(jié)論通過(guò)活化PLC-γ1信號(hào)通路，CAP可抑制RBE細(xì)胞的增殖能力，并促進(jìn)RBE細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞〔〕辣椒素；磷脂酶C-P1信號(hào)通路；膽管癌

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R73〔

第一作者：江愷(1986-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事肝膽胰外科疾病研究。

膽管癌(CCA)具有惡性程度高、預(yù)后差等特點(diǎn)，死亡原因多為腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移〔1〕。已知CCA的危險(xiǎn)因素包括原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)、肝硬化、慢性乙型和丙型肝炎病毒感染、糖尿病、肥胖、吸煙和飲酒等〔2，3〕。CCA通常在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于癌癥的晚期，僅能采用光動(dòng)力治療(PDT)、全身化療和(或)放射治療，即便如此患者的治愈率卻未得到明顯提高。辣椒素(CAP)是從紅辣椒的果實(shí)中萃取物獲得的紅辣椒活性成分，不僅能減少炎癥及疼痛，還對(duì)多種胃腸道腫瘤細(xì)胞具有抗增殖的作用〔4〕。然而，CAP在腫瘤形成中的作用目前還存在很大爭(zhēng)議；也有文獻(xiàn)報(bào)道，CAP具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的作用〔5〕。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察CAP對(duì)CCA腫瘤細(xì)胞系增殖和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理人CCA細(xì)胞系RBE用含10%胎牛血清(BSA)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合進(jìn)行傳代培養(yǎng)，至細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開(kāi)始功能實(shí)驗(yàn)?；罨瘜?shí)驗(yàn)中采用0、50、100、150、200 μmol/L的CAP及200 μmol/L的CAP處理0、24、48、72 h。

1.2細(xì)胞總蛋白提取上述CAP處理細(xì)胞以冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，400 r/min離心，5 min；于細(xì)胞沉淀中加入蛋白酶磷酸酶抑制劑和適量的CytoBuster 蛋白提取試劑，高速渦旋細(xì)胞裂解混合物25 s，室溫放置15 min；4℃，12 000 r/min離心15 min；吸取上清部分即細(xì)胞總蛋白，除留部分樣品檢測(cè)蛋白濃度外，其余分裝10 μl/管，-80℃凍存。

1.3二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品BSA稀釋；按體積比50∶1混合BCA 試劑盒中的試劑A和試劑B，獲取工作液；ELISA板中每孔加入200 μl工作液，隨后加入25 μl倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，每種樣品設(shè)置3復(fù)孔。37℃孵育30 min；振蕩器短暫混勻后在波長(zhǎng)562 nm處測(cè)定OD值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值和濃度梯度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣品的OD值推算各蛋白樣品濃度。

1.4Western印跡等量的提取蛋白經(jīng)5%濃縮膠和8%的分離膠分離后，半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以含5% BSA的Tris鹽酸緩沖液(TBST)室溫封閉2 h，加入一抗4℃過(guò)夜孵育。第二天用0.1% TBST洗膜3次，每次5 min，加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酸(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。0.1% TBST洗膜3次，硝酸纖維素膜以Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化學(xué)發(fā)光底物對(duì)條帶進(jìn)行顯色。β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.5噻唑藍(lán)(MTT)增殖檢測(cè)上述CAP處理的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔中加入20 μl的MTT溶液，作用4 h后吸出上清，加入150 μl的DMSO溶液，低速振蕩10 min后，波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定OD值。阻斷磷脂酶C(PLC)-γ1信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)中，在加入完全培養(yǎng)基及CAP前，先以U73122(5 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1 h。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)孔平均值/對(duì)照孔平均值)×100%。

1.6凋亡率檢測(cè)收集上述CAP處理的細(xì)胞，1 000 r/min離心，5 min，1% BSA PBS洗滌1次。用100 μl Binding緩沖液將細(xì)胞重懸，加入2 μl Annexin V染料和0.1 μl碘化丙啶(PI)染料，避光15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。阻斷PLC-γ1信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)中，在加入完全培養(yǎng)基及CAP前，先以U73122(5 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1 h。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1CAP對(duì)RBE細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響CAP可顯著抑制RBE細(xì)胞的增殖能力，并促進(jìn)RBE細(xì)胞的凋亡；隨著CAP濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，RBE細(xì)胞的增殖能力逐漸降低(P<0.01)，而凋亡水平則逐漸升高(P<0.01。見(jiàn)表1。

2.2CAP對(duì)RBE細(xì)胞中PLC-γ1信號(hào)通路活化的影響隨著CAP濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，RBE細(xì)胞中PLC-γ1信號(hào)通路活化水平逐漸升高。見(jiàn)圖1。

表1　CAP對(duì)RBE細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響

與前一組比較：1)P<0.01

A：不同濃度CAP處理RBE細(xì)胞后；B：200 μmol/L CAP處理RBE細(xì)胞不同時(shí)間 圖1　Western印跡檢測(cè)CAP對(duì)RBE細(xì)胞中 PLC-γ1蛋白磷酸化(P-PLC-γ1)水平的影響

2.3U73122可阻斷RBE細(xì)胞中PLC-γ1信號(hào)通路活化以U73122(5 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1 h，可顯著阻斷RBE細(xì)胞中PLC-γ1信號(hào)通路的活化。見(jiàn)圖2。

2.4PLC-γ1信號(hào)通路在CAP調(diào)控RBE細(xì)胞增殖和凋亡中的作用與CAP處理組相比，阻斷RBE細(xì)胞中PLC-γ1信號(hào)通路后，RBE細(xì)胞的增殖能力顯著升高(P<0.01)，凋亡水平則顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

圖2　PLC-γ1信號(hào)通路阻斷效果檢測(cè)

組別增殖率凋亡率對(duì)照組93.56±93.564.94±1.99CAP組14.56±14.561)40.45±7.461)CAP+U73122組92.45±18.241)5.34±2.011)

與前一組比較：1)P<0.01

3討論

本研究結(jié)果顯示，CAP可顯著抑制人CCA細(xì)胞系RBE的增殖能力，并促進(jìn)RBE細(xì)胞凋亡。與文獻(xiàn)〔6，7〕報(bào)道的CAP對(duì)多種胃腸道腫瘤細(xì)胞具有抗增殖的作用，以及CAP可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖能力相一致。然而，也有文獻(xiàn)〔8〕報(bào)道，CAP具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的作用。這些文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果的不一致可能是因?yàn)轶w外實(shí)驗(yàn)條件的不同，已知胰島素在低濃度時(shí)具有存進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用，而高濃度時(shí)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖。因此，不同實(shí)驗(yàn)中采用的CAP濃度不同可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的不同。此外，也可能是不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)CAP的反應(yīng)性不同所致。已知CAP可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的Ca2+流動(dòng)而對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡發(fā)揮調(diào)控作用〔9〕。PLC-γ1信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的Ca2+流動(dòng)中具有重要的作用。激活的PLC-γ1可通過(guò)分解磷脂酰肌醇 4，5-二磷酸(PIP2)而產(chǎn)生甘油二酯(DAG)和 1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)，IP3與細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)中的IP3受體結(jié)合即可引起細(xì)胞內(nèi)的Ca2+流動(dòng)〔10〕。本文結(jié)果顯示，在阻斷PLC-γ1信號(hào)通路后，CAP抑制RBE細(xì)胞的增殖能力以及促進(jìn)RBE細(xì)胞的凋亡能力均被顯著阻斷。

綜述所述，本研究結(jié)果提示CAP可通過(guò)激活RBE細(xì)胞中的PLC-γ1信號(hào)通路，引起細(xì)胞內(nèi)的Ca2+流動(dòng)，進(jìn)而抑制RBE細(xì)胞的增殖能力，并促進(jìn)RBE細(xì)胞的凋亡水平，從而在CCA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的治療作用。已知Ca2+流動(dòng)在維持細(xì)胞的增殖活化中也具有重要作用，CAP通過(guò)調(diào)控Ca2+流動(dòng)而抑制RBE細(xì)胞的增殖能力，并促進(jìn)RBE細(xì)胞的凋亡水平這一作用可能與破壞了RBE細(xì)胞內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)有關(guān)，然而確切的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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〔2015-01-21修回〕

(編輯袁左鳴)