枸櫞酸誘發(fā)豚鼠咳嗽模型實(shí)驗(yàn)條件

盧素紅張超然1吳先林2徐擁建

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510632)

摘要〔〕目的研究可能影響枸櫞酸誘發(fā)豚鼠咳嗽模型的多種因素，減小外界因素對(duì)模型制作的影響，復(fù)制出穩(wěn)定的豚鼠咳嗽模型。方法比較不同體重、性別、霧化容積和霧化時(shí)間條件對(duì)枸櫞酸誘發(fā)豚鼠咳嗽的影響。結(jié)果在相同實(shí)驗(yàn)條件下，體重180～220 g豚鼠的咳嗽次數(shù)明顯多于體重280～320 g；體重180～220 g豚鼠咳嗽潛伏期明顯短于體重280～320 g；5 L霧化容積中豚鼠咳嗽的次數(shù)明顯比3 L多；雌性豚鼠的咳嗽潛伏期長(zhǎng)于雄性；性別和枸櫞酸霧化時(shí)間對(duì)豚鼠咳嗽次數(shù)的影響不明顯。結(jié)論體重和霧化容積對(duì)豚鼠咳嗽次數(shù)可產(chǎn)生明顯影響，在運(yùn)用枸櫞酸制作豚鼠咳嗽模型時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，有利于復(fù)制出穩(wěn)定的咳嗽模型。

關(guān)鍵詞〔〕咳嗽模型；枸櫞酸

中圖分類號(hào)〔〕R56〔

1廣東省中醫(yī)院2暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院

第一作者：盧素紅(1982-),男,博士,主要從事心腦血管病研究。

咳嗽主要涉及環(huán)節(jié)包括：傳入神經(jīng)、呼吸道神經(jīng)末梢感受器、延髓咳嗽中樞和傳出神經(jīng)。人體呼吸道黏膜上神經(jīng)末梢感受器上分布著許多機(jī)械感受器、化學(xué)感受器和肺牽張感受器，當(dāng)黏液、灰塵或異物等機(jī)械刺激及煙熏、毒氣等化學(xué)刺激呼吸道感受器時(shí)，支氣管痙攣引起肌張力增加，神經(jīng)末梢感受器接受信號(hào)，激活“咳嗽受體”，將傳入沖動(dòng)沿迷走神經(jīng)傳入纖維，傳至延髓咳嗽中樞孤立束神經(jīng)核區(qū)，在該部位整合各種傳入沖動(dòng)，興奮位于延髓背側(cè)部的咳嗽中樞，引發(fā)咳嗽〔1〕。關(guān)于咳嗽動(dòng)物模型的論述均以少數(shù)經(jīng)典、具代表性的動(dòng)物模型為主，如：多采用機(jī)械、化學(xué)和電刺激等方法刺激動(dòng)物的神經(jīng)和感受器，引發(fā)咳嗽。本實(shí)驗(yàn)室比較不同體重、不同性別、不同霧化容積和不同霧化時(shí)間條件，對(duì)枸櫞酸誘發(fā)豚鼠咳嗽的影響，旨在為枸櫞酸致豚鼠咳嗽模型提供最佳的方法學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Hartley豚鼠，SPF級(jí)，180～220 g，100只；280～320 g，30只，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：0106662，使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2008-0003，廣東省科學(xué)技術(shù)廳簽發(fā)。豚鼠飼養(yǎng)籠材質(zhì)為不銹鋼，飼養(yǎng)籠尺寸為55 cm×37 cm×40 cm，群養(yǎng)。動(dòng)物房環(huán)境溫度范圍控制在19℃～26℃，日溫差不超過4℃，相對(duì)濕度范圍控制在40%～70%，換氣次數(shù)為8～10次/h，12 h照明/12 h黑暗明暗交替，工作照度為150-300Lx，動(dòng)物照度為100-200Lx。

1.2材料枸櫞酸分析純，廣州化學(xué)試劑廠，規(guī)格：500 g/瓶，批號(hào)：20100204-2。電子天平BS224S、BP34，2013年已檢定，均為一年檢定一次，均為北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品。超聲霧化器為廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司產(chǎn)品。

1.3方法試驗(yàn)前進(jìn)行動(dòng)物篩選：將豚鼠分別置于5 L燒杯內(nèi)，燒杯用保鮮膜密閉，開一小口與超聲霧化器的玻璃管相連，采用噴霧器默認(rèn)的最大噴霧力度(MAX)，超聲霧化器將17.5%枸櫞酸溶液噴入燒杯，持續(xù)霧化0.5 min(30 s)后，立即將超聲霧化器的霧化管與燒杯斷開。在通入枸櫞酸的同時(shí)，用秒表計(jì)時(shí)，記錄自噴霧起5 min內(nèi)豚鼠咳嗽次數(shù)(豚鼠引嘴并聽到響亮咳聲，為一次咳嗽)，低于10次者，不予選取〔2〕。將篩選合格的Hartley豚鼠100只，平均分成5組，見表1。在篩選結(jié)束后第三天同上法引咳，在噴霧枸櫞酸溶液的同時(shí)，用秒表計(jì)時(shí)，記錄豚鼠5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)(次)和咳嗽潛伏期(s)?？人詽摲凇?〕指噴霧枸櫞酸開始時(shí)間至發(fā)生咳嗽所需的秒數(shù)，咳嗽的表現(xiàn)為：豚鼠咳嗽聲響亮，應(yīng)以聽到計(jì)算。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析，當(dāng)組間方差齊時(shí)，組間比較采用Student-T檢驗(yàn)(非配對(duì)T檢驗(yàn))；組間方差不齊時(shí)，采用校正的Student-T檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1性別對(duì)豚鼠咳嗽次數(shù)的影響B(tài)組咳嗽潛伏期明顯長(zhǎng)于A組(P<0.05)，B組咳嗽次數(shù)略少于A組，差異不顯著(P>0.05)。見表1。

2.2體重對(duì)豚鼠咳嗽次數(shù)的影響C組比A組咳嗽潛伏期明顯延長(zhǎng)，咳嗽次數(shù)明顯減少(P<0.01)。見表1。

2.3霧化時(shí)間對(duì)豚鼠咳嗽次數(shù)的影響D組與A組咳嗽次數(shù)和咳嗽潛伏期差異不顯著(P>0.05)。見表1。

2.4霧化容積對(duì)豚鼠咳嗽次數(shù)的影響E組咳嗽次數(shù)明顯低于A組(P<0.05)，但咳嗽潛伏期差異不顯著(P>0.05)。見表1。

表1　各種實(shí)驗(yàn)條件對(duì)枸櫞酸致豚鼠咳嗽的影響( n=20)

與A組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3討論

化學(xué)刺激法致豚鼠霧化吸入枸櫞酸，引發(fā)咳嗽，具有霧化時(shí)間和濃度可控，操作簡(jiǎn)單、豚鼠咳嗽聲大、易于辨別等優(yōu)點(diǎn)。枸櫞酸致豚鼠咳嗽模型是常用的動(dòng)物咳嗽模型，但目前各文獻(xiàn)對(duì)枸櫞酸誘發(fā)咳豚鼠咳嗽模型的各種試驗(yàn)條件記載不一致，霧化時(shí)間為10、30、60 s等、霧化容積有3、5 L燒杯等。

年齡階段的不同導(dǎo)致了體重差異，而不同階段的年齡對(duì)化學(xué)刺激的敏感性是不一致的，如兒童支氣管黏膜血管豐富，黏液分泌量少，纖毛運(yùn)動(dòng)差而清掃能力弱，故對(duì)化學(xué)刺激更加敏感。一般來說，年齡越小，對(duì)化學(xué)刺激越敏感，所以體重輕的豚鼠對(duì)枸櫞酸更敏感，咳嗽次數(shù)多、咳嗽潛伏期短。

在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，雌性動(dòng)物的咳嗽潛伏期長(zhǎng)于雄性，與劉軍等〔4〕的研究一致，考慮原因是雌激素對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用，導(dǎo)致雌性豚鼠更耐受，這點(diǎn)提示在實(shí)驗(yàn)過程中，不同受試物組的雌雄動(dòng)物數(shù)應(yīng)一致，盡量避免因性別而導(dǎo)致的模型差異。

在相同條件下，霧化時(shí)間30 s與60 s雖未見顯著性差異，但霧化結(jié)束后，霧化時(shí)間60 s的豚鼠精神狀態(tài)較差，所以在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選擇引咳效果佳且對(duì)動(dòng)物造成損傷小的最佳霧化時(shí)間。

本文5 L霧化容積對(duì)模型的影響與王靜波〔5〕的研究一致，考慮與通氧情況有關(guān)。在實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)注意超聲霧化器藥杯內(nèi)枸櫞酸的體積量會(huì)影響霧化濃度，所以實(shí)驗(yàn)過程中要統(tǒng)一藥杯內(nèi)枸櫞酸的容積。本研究中，藥杯內(nèi)每次添加枸櫞酸溶液的體積為20 ml，做完3只豚鼠后更換枸櫞酸溶液，可以防止揮發(fā)。不同的霧化器即使霧化濃度相同，也可能會(huì)存在一定的差異。因此，霧化過程中要將各組動(dòng)物均勻分到各個(gè)霧化器。總之，影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素有很多，包括動(dòng)物自身因素、飼養(yǎng)環(huán)境因素、營(yíng)養(yǎng)因素、實(shí)驗(yàn)技術(shù)因素等，因此必須嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件才能獲得準(zhǔn)確、可重復(fù)性的動(dòng)物模型。

4參考文獻(xiàn)

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3羅霄山，許家騮，張誠(chéng)光，等.咳喘樂顆粒鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中藥材，2004；27(7)：520-1.

4劉軍，石璐，黃雷雷，等.枸櫞酸引咳豚鼠動(dòng)物模型的方法學(xué)研究〔J〕.四川醫(yī)學(xué)，2009；30(4)：463-4.

5王靜波.枇杷花止咳抗炎藥效學(xué)研究〔D〕.成都：四川師范大學(xué)，2009：20-1.

〔2014-10-26修回〕

(編輯安冉冉/張慧)

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