新宮頸癌腫瘤標(biāo)志物P16自身抗體的表達(dá)

于士龍1陳健1金剛1孫寶勝2李彥豪

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東廣州510515)

摘要〔〕目的研究早期宮頸惡性腫瘤、宮頸良性腫瘤和健康人群P16自身抗體表達(dá)情況。方法利用自行設(shè)計(jì)的P16表位多肽片段作為包被抗原，采用改良EliSA方法檢測(cè)141例宮頸癌患者、133例宮頸良性腫瘤患者和148例健康志愿者血漿中P16自身抗體的表達(dá)情況。結(jié)果惡性腫瘤組P16自身抗體表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組(t=4.016，P<0.001)和良性腫瘤組(t=3.879，P<0.001)。Ⅰ期宮頸癌組和Ⅱ期宮頸癌組P16表達(dá)水平明顯高于健康人群(t=7.800，P<0.001;t=5.198，P<0.001)及良性腫瘤組(t=4.466，P<0.001；t=2.288，P<0.001)，且Ⅰ期宮頸癌組與Ⅱ期宮頸癌組P16自身抗體表達(dá)水平存在差異(t=2.012，P<0.05)。宮頸癌組特異度為90%時(shí)，敏感度15.6%，曲線下面積為0.652。Ⅰ期宮頸癌組抗P16的IgG自身抗體特異度為90%時(shí)，敏感度達(dá)到了20.3%，曲線下面積為0.719。結(jié)論P(yáng)16作為一種腫瘤相關(guān)抗原，其自身抗體可以反映出宮頸病變的連續(xù)發(fā)展變化，可能是早期診斷宮頸病變的一種潛在血清學(xué)標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞〔〕自身抗體；腫瘤相關(guān)抗原；宮頸癌；P16

中圖分類號(hào)〔〕R737.33〔

通訊作者：李彥豪(1953-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事介入放射學(xué)研究。

1吉林省腫瘤醫(yī)院介入科2吉林省腫瘤醫(yī)院放療科

第一作者：于士龍(1976-)，男，在讀博士，主治醫(yī)師，主要從事介入放射學(xué)研究。

相關(guān)研究表明，P16 基因是一種腫瘤抑制基因，可直接作用于細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞分裂，使細(xì)胞周期停滯在G1期。因此，P16基因失活可能是細(xì)胞惡化的關(guān)鍵。腫瘤發(fā)生時(shí)，腫瘤內(nèi)異常表達(dá)的蛋白、多肽等會(huì)成為腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性自身抗體。研究表明TAA自身抗體在多種惡性腫瘤患者中表達(dá)明顯升高〔1～5〕，檢測(cè)腫瘤患者血清中TAAs自身抗體可達(dá)到診斷或輔助診斷相關(guān)腫瘤的目的。在我們前期的工作中，應(yīng)用線性肽代替重組蛋白作為TAA抗原的ELISA法檢測(cè)自身抗體，已經(jīng)證實(shí)具有MHC-Ⅱ類表位的線性肽可以與自身抗體結(jié)合，并在多種腫瘤檢測(cè)中具有較高的敏感性。我們已發(fā)現(xiàn)P16自身抗體在食管癌和非小細(xì)胞肺癌患者中表達(dá)明顯高于健康人群，然而宮頸癌中腫瘤自身抗體的研究鮮有報(bào)道。本研究擬探討P16自身抗體在宮頸腫瘤人群血清中的表達(dá)趨勢(shì)及意義。

1材料與方法

1.1樣品來源樣品來自吉林大學(xué)第二醫(yī)院300名初次確診為宮頸癌的女性患者。均由影像學(xué)和病理組織學(xué)診斷確認(rèn)，具有全面的臨床資料信息，并在血漿樣品采集前未進(jìn)行任何抗癌治療。同時(shí)招募150名健康女性，采集外周血作為健康對(duì)照樣本。所有研究對(duì)象均為中國(guó)人，同時(shí)給予書面知情同意書，經(jīng)吉林大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。由于首次就診的晚期患者非常少，樣本少見，且晚期宮頸癌的診斷方法臨床上已經(jīng)很成熟，所以本次研究只納入Ⅰ期和Ⅱ期宮頸癌患者為惡性腫瘤組，剔除Ⅲ期和Ⅳ期宮頸癌的樣品。另外，剔除患有嚴(yán)重自身免疫疾病和其他腫瘤的樣本。符合研究要求的腫瘤樣本共274例，其中宮頸良性腫瘤133例，惡性腫瘤141例。符合要求的健康對(duì)照148例。

1.2自身抗體檢測(cè)方法采用改良的ELISA法對(duì)P16 IgG自身抗體進(jìn)行檢測(cè)。線性抗原肽根據(jù)人白細(xì)胞抗原Ⅱ型(HLA-Ⅱ)設(shè)計(jì)而成，能與人類p16蛋白對(duì)應(yīng)并攜帶能被多于90%的中國(guó)人識(shí)別的重疊限制表位，純度>95%，同時(shí)選取與人類抗原表位不相同的玉米多肽抗原作為參照抗原。合成肽用67%冰醋酸溶解，得到5 mg/ml 的抗原存儲(chǔ)液，使用前用含有0.1%疊氮鈉NaN3(S2002，Sigma-Aldrich)的磷酸鹽緩沖液(PBS，P4417，Sigma-Aldrich)將P16抗原和對(duì)照玉米抗原分別稀釋至10 μg/ml。將稀釋后的P16抗原及對(duì)照玉米抗原以0.1 ml/孔的量包被96孔平底透明微量滴定板(產(chǎn)品號(hào)3590，ImmunoChemistry Technologies)。96孔板用封板膜封閉后，4℃下孵育過夜。將抗原包被的96孔板用含Tween?20的Tris鹽緩沖液(TBS)清洗三次。用分析液按1∶150稀釋血漿樣本(100 μl/孔)，同時(shí)將分析液(100 μl/孔)加入陰性對(duì)照孔中。在37℃孵箱中孵育1.5 h后洗板3次，加入以1∶20 000倍稀釋的過氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG抗體(A8667，Sigma-Aldrich、100 μl/孔)，封板膜封閉后在37℃孵箱中孵育1 h。然后洗板3次，加入顯色劑四甲基聯(lián)苯胺(TMB，S1301，Life Technologies)每孔100 μl，顯色20～30 min后加入50 μl終止液(10.9%的硫酸溶液)。將酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)定為450 nm及620 nm作為參考波長(zhǎng)，在終止反應(yīng)后10 min內(nèi)，測(cè)定樣品的光密度(OD)值。為了避免非特異吸收信號(hào)的干擾，用特意結(jié)合指數(shù)(SBI)表示血漿中循環(huán)自身抗體P16的水平。SBI=〔P16抗原(OD)-NC(OD)〕/〔對(duì)照抗原(OD)-NC(OD)〕

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS21.0軟件行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；利用受試者工作特征曲線(ROC)分析特異性>90%的情況下ELASA方法的敏感性。

2結(jié)果

2.1各組之間P16自身抗體表達(dá)水平比較惡性腫瘤組P16自身抗體表達(dá)水平(1.196±0.227)顯著高于健康對(duì)照組(1.098±0.188)(t=4.016，P<0.001)及良性腫瘤組(1.093±0.212)(t=3.879，P<0.001)。良性腫瘤組P16自身抗體表達(dá)水平與健康對(duì)照組之間無明顯差異(t=0.209，P=0.834)。P16自身抗體的表達(dá)水平在健康對(duì)照組、良性腫瘤組和惡性腫瘤組中有依次升高的趨勢(shì)。

2.2不同腫瘤分期間P16自身抗體表達(dá)水平的比較Ⅰ期宮頸癌組(1.331±0.212)和Ⅱ期宮頸癌組(1.244±0.234)P16表達(dá)水平明顯高于健康人群(t=7.800，P<0.001;t=5.198，P<0.001)及良性腫瘤組(t=4.466，P<0.001；t=2.288，P<0.001)。Ⅰ期宮頸癌組與Ⅱ期宮頸癌組P16自身抗體表達(dá)水平也存在差異(t=2.012，P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3ROC分析惡性腫瘤組IgG檢測(cè)在特異度90%時(shí)，敏感度15.6%，曲線下面積為0.652(SE=0.032，95%CI:0.588～0.715)。Ⅰ期宮頸癌組IgG檢測(cè)在特異度90%、敏感度20.3%時(shí)，ROC為0.719(SE=0.039，95%CI:0.642～0.796)；Ⅱ期宮頸癌組IgG檢測(cè)在特異度90%時(shí)，敏感度12.2%，ROC為0.604(SE=0.040，95%CI:0.525～0.682)。見圖1。

圖1　宮頸癌及其各分期中P16自身抗體的ROC分析

3討論

大量研究表明，機(jī)體對(duì)自身腫瘤成分能夠產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)〔6，7〕，從而產(chǎn)生腫瘤相關(guān)抗原自身抗體。免疫應(yīng)答在癌癥早期起到生物信號(hào)放大作用，使得在腫瘤抗原水平很低，利用常規(guī)蛋白檢測(cè)方法無法檢出時(shí)，就可以檢測(cè)到該腫瘤抗原自身抗體的異常表達(dá)〔7，8〕。因此血清中自身抗體的水平對(duì)監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生具有重大意義〔9〕。

研究證實(shí)P16蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)增高〔10，11〕，過表達(dá)的P16蛋白可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更多的P16自身抗體。本研究結(jié)果提示P16自身抗體可以成為宮頸癌發(fā)生的生物標(biāo)記物，并且在宮頸癌發(fā)生早期具有重要的診斷價(jià)值，與Jin等〔12〕和FOXP3〔13〕自身抗體在Ⅰ期食管癌中表達(dá)最高的研究結(jié)果相類似，進(jìn)一步證實(shí)自身抗體在腫瘤早期診斷的潛在作用。P16基因在宮頸癌中的表達(dá)與其抑癌基因形象并不相符，P16蛋白在宮頸癌中表達(dá)升高，并隨著病變加重有逐漸升高的趨勢(shì)。目前對(duì)于P16蛋白升高主要存在兩種解釋。首先P16蛋白的表達(dá)升高可能與Rb基因失活有關(guān)。在正常宮頸組織中pRb可抑制P16基因的表達(dá)，P16與pRb之間通過負(fù)調(diào)節(jié)維持著兩者之間的精確平衡。當(dāng)宮頸癌發(fā)生時(shí)，Rb基因的失活導(dǎo)致功能性pRb蛋白缺失，進(jìn)而使得P16的抑制解除，導(dǎo)致P16表達(dá)升高。其次，研究報(bào)道P16的表達(dá)升高可能與HPV的感染有關(guān)。已證實(shí)HPV感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病的主要原因。HPV感染引起P16高表達(dá)的機(jī)制可能是HPV癌基因E6、E7編碼的癌蛋白，能分別與宿主的抑癌基因產(chǎn)物P53和pRb結(jié)合，導(dǎo)致P53表達(dá)下降和pRb功能喪失，使其對(duì)P16的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用喪失，從而導(dǎo)致P16蛋白在宮頸癌中過度表達(dá)。多數(shù)腫瘤中都能檢測(cè)到Rb基因的失活，但僅只發(fā)現(xiàn)在宮頸癌、頭頸部鱗癌等少數(shù)癌中存在P16蛋白的過表達(dá)的現(xiàn)象。雖然宮頸癌發(fā)生中HPV感染與P16蛋白表達(dá)升高的內(nèi)在機(jī)制尚不清楚，但HPV感染誘導(dǎo)P16蛋白表達(dá)升高為P16自身抗體作為宮頸癌的生物標(biāo)記物提供了有力的理論基礎(chǔ)。

敏感度和特異度是血清學(xué)診斷標(biāo)志物重要的衡量指標(biāo)。Li等〔14〕和Zhang等〔15〕分別以TAA重組蛋白為抗原檢測(cè)了卵巢癌和肝癌中P16自身抗體的表達(dá)，其敏感性分別為25%和21.8%。Liu等〔16〕和Ye等〔17〕用同樣方法對(duì)乳腺癌進(jìn)行檢測(cè)，敏感性分別為14.3%和12.2%。以上研究中發(fā)現(xiàn)P16自身抗體檢測(cè)在腺癌中較為敏感，而在鱗癌檢測(cè)中，Zhou等〔18〕以TAA重組蛋白為抗原檢測(cè)食管癌，P16敏感性較低。傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物在良性腫瘤中也有升高的現(xiàn)象，是限制診斷敏感性的因素之一。之前的研究很少納入良性組，本研究中雖然良性組和健康組之間不存在差異，但是惡性組顯著高于良性組，這也說明P16自身抗體在宮頸惡性腫瘤診斷方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

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〔2014-10-17修回〕

(編輯徐杰)