老年SD大鼠脾臟和外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化

張江蘭李蕓吉靈改任君旭張耕吳靖芳

(河北北方學(xué)院，河北張家口075000)

摘要〔〕目的探討 SD老年大鼠脾臟和外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化。方法流式細(xì)胞儀檢測老年大鼠(10只)和青年鼠(5只)脾臟和血液T淋巴細(xì)胞亞群的變化。結(jié)果SD老年大鼠脾臟和外周血T淋巴細(xì)胞亞群陽性率的變化相一致，CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞陽性率均低于青年組水平，且CD4細(xì)胞陽性率均明顯低于青年組(P<0.05)；CD4+/CD8+比值均低于青年組，在脾臟CD4+/CD8+比值與青年組相比具有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論SD老年大鼠脾臟和外周血T胞亞群陽性率均減少，且CD4+/CD8+比值明顯降低，提示SD老年大鼠免疫功能的衰退和紊亂與T細(xì)胞密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕脾臟；外周血；淋巴細(xì)胞；流式細(xì)胞技術(shù)

中圖分類號〔〕R57〔

基金項目：張家口市科技攻關(guān)計劃(12110065G-1)；河北北方學(xué)院自然科學(xué)研究計劃項目(No.2001022)

第一作者：張江蘭(1981-),女,講師,主要從事胃潰瘍病及其神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)研究。

在免疫系統(tǒng)中，各淋巴細(xì)胞亞群之間相互作用，維持著機(jī)體的正常免疫功能，隨著年齡的增長，各淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能均會發(fā)生不同程度的改變。美國病理學(xué)家Wolford首次提出老化的免疫學(xué)假設(shè)，認(rèn)為免疫系統(tǒng)是調(diào)節(jié)老化過程的主要系統(tǒng)之一，其從根本上參與了機(jī)體老化的整個過程〔1〕。本實驗通過免疫熒光標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)檢測SD老年大鼠脾臟和外周血淋巴細(xì)胞各亞群的變化。

1材料與方法

1.1材料20月齡SD老年大鼠共10只，6月齡SD青年鼠5只，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。然后在本組長期飼養(yǎng)，體重280～300 g。小鼠抗大鼠單克隆抗體：CD3-PE、CD4-FITC、CD8-FITC和10×細(xì)胞裂解液(FACS Lysing Solution)，均購自美國BD/Pharmingen 公司。流式細(xì)胞儀(FACS Aria)購自美國BD公司。

1.2取材用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉。動物被麻醉后，迅速開胸，心臟穿刺取血，放置于肝素抗凝管中，行流式細(xì)胞儀檢測；迅速開腹，采取脾組條，立即進(jìn)行FACS檢測。

1.3脾臟組織淋巴細(xì)胞亞群檢測采集大鼠脾臟組織，放入200目不銹鋼篩網(wǎng)，使用注射器針心研磨；收集細(xì)胞，沉降5 min，轉(zhuǎn)入另一肝素抗凝試管中，1 500 r/min，離心10 min，棄上清；加入紅細(xì)胞裂解液2 ml充分混勻，避光放置10 min，4℃ 1 500 r/min，5 min離心去上清，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液(pH7.4)洗滌；用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)1×106/ml，取300 μl細(xì)胞懸液，平均加入到2個上樣管中，每管分別加入CD3-PE/CD4-FITC和CD3-PE/CD8-FITC，同時設(shè)立空白對照組(不加任何抗體)，4℃避光反應(yīng)30 min，4℃ 1 500 r/min，5 min離心去上清；0.01 mol/LPBS緩沖液(pH7.4)洗滌；加200 μl PBS重懸細(xì)胞，逐個安放在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。數(shù)據(jù)用Cellquest3.1進(jìn)行熒光參數(shù)的獲取和分析。在進(jìn)行流式分析時，首先射門于淋巴細(xì)胞，然后射門于CD4+和CD8+細(xì)胞，分析各淋巴細(xì)胞亞群的陽性率。

1.4外周血淋巴細(xì)胞亞群的檢測每只動物取抗凝血300 μl平均加入到2個上樣管中，每管分別加入CD3-PE/CD4-FITC和CD3-PE/CD8-FITC，同時設(shè)立空白對照組(不加任何抗體)，4℃避光反應(yīng)30 min；每管加入1×細(xì)胞裂解液2 ml充分混勻，避光放置10 min，4℃ 1 500 r/min，5 min離心去上清，0.01 mol/L PBS緩沖液(pH7.4)洗滌2次；加200 μl PBS重懸細(xì)胞，逐個安放在FACS上進(jìn)行檢測。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件行ANOVA方差分析及q檢驗。

2結(jié)果

SD老年大鼠脾臟和外周血各淋巴細(xì)胞亞群陽性率的變化一致，CD3+、CD4+、CD8細(xì)胞陽性率均低于青年組水平；其中CD4+細(xì)胞陽性率均明顯低于青年組(P<0.05)；脾臟和外周血CD4+/CD8+比值均低于青年組，兩組脾臟CD4+/CD8+比值差異顯著(P<0.05)。見表1。

表1　老年SD大鼠脾臟和外周血T淋巴細(xì)胞亞群的

與青年組比較：1)P<0.05

3討論

淋巴細(xì)胞各亞群數(shù)量的減少和功能的改變是老年人免疫功能衰退的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)老年SD大鼠脾臟和外周血總T淋巴細(xì)胞(CD3+)，抑制性、殺傷T淋巴細(xì)胞(CD8+)，輔助性T淋巴細(xì)胞(CD4+)陽性率均較青年組低。老年人免疫器官的衰退, 最突出的表現(xiàn)是T、B細(xì)胞的功能減退, 對非特異性有絲分裂原PHA、ConA及外來抗原反應(yīng)性降低, 導(dǎo)致免疫功能下降, 易發(fā)生感染。陳海英等〔2〕研究顯示老年組的胸腺細(xì)胞大量萎縮或凋亡，從胸腺遷移到外周活化的T細(xì)胞減少，這被認(rèn)為是老年脾臟和外周血T細(xì)胞數(shù)量減少的主要原因之一；同時，T細(xì)胞功能也隨增齡而惡化，造成細(xì)胞對外界信號的反應(yīng)性和胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)異?！?〕，且表達(dá)抗bcl-2抗凋亡蛋白水平增高〔4〕，使具有免疫能力的T細(xì)胞持續(xù)的存活，這不僅使機(jī)體免疫功能下降，還可能會對自身產(chǎn)生攻擊, 使機(jī)體易患自身免疫病、病毒感染和腫瘤等多種疾病。

同時，CD4+和CD8+細(xì)胞是一對相互制約的細(xì)胞〔5，6〕,生理狀態(tài)下其數(shù)目在周圍組織中保持相對穩(wěn)定,以維持機(jī)體正常的細(xì)胞免疫功能，且CD4+/CD8+值可反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，其值增高或降低都將影響機(jī)體的免疫功能異?；蛭蓙y〔7〕，導(dǎo)致臨床上許多疾病的產(chǎn)生。本實驗證實SD老年大鼠細(xì)胞免疫功能異常和紊亂，也是機(jī)體免疫功能下降的重要原因。

總之，機(jī)體免疫老化是一個非常復(fù)雜的過程，對其具體機(jī)制的研究具有重要的意義。本實驗發(fā)現(xiàn)SD老年大鼠免疫系統(tǒng)功能的衰退與T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的減少和功能降低密切相關(guān)，為機(jī)體免疫衰老機(jī)制的研究提供了實驗依據(jù)。

4參考文獻(xiàn)

1何維.在免疫老化中T細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化〔J〕.中國免疫學(xué)雜志,2001;17(1):57-60.

2陳海英,陳建明,鄭建盛.胸腺細(xì)胞漸進(jìn)性凋亡對大鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖功能的影響〔J〕.長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009;23(2):95-8.

3趙嵐,韓鸚贏,沈鵬,等.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與衰老關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.國際老年醫(yī)學(xué)雜志,2010;31(4):157-61.

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6潘志文,楊凡,萬海英.不同認(rèn)知功能老年人淋巴細(xì)胞亞群和超敏C反應(yīng)蛋白分析〔J〕.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2007;28(6):96-9.

7許麗艷，張盈華，尹國武，等.子宮內(nèi)膜癌患者T細(xì)胞亞群、紅細(xì)胞免疫與Ag、NORs定量分析的臨床意義〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2001;22(4): 353-5.

〔2014-05-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

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