蘇拉明對腫瘤上清液誘發(fā)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力的影響

徐永良孫平張大偉馮克儉張偉1

(牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江牡丹江157011)

摘要〔〕目的檢測蘇拉明對肺癌Calu-1細(xì)胞上清液誘發(fā)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力的影響。方法應(yīng)用免疫熒光染色對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定；應(yīng)用Matrigel立體培養(yǎng)法檢測淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力。結(jié)果蘇拉明對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成能力無顯著影響；腫瘤上清液能夠增強(qiáng)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成能力，呈劑量依賴性；而蘇拉明能夠抑制腫瘤上清液誘發(fā)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成，并呈劑量依賴性。結(jié)論腫瘤上清液能夠促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成，而蘇拉明能夠抑制這種促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞〔〕蘇拉明；淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞；腫瘤上清液；管腔形成能力

中圖分類號〔〕R730.2〔

項(xiàng)目基金

通訊作者：張偉(1976-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤血管和淋巴管生成的分子機(jī)制與調(diào)控研究。

1牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院

第一作者：徐永良(1978-)，男，碩士，主要從事淋巴管形態(tài)學(xué)及其發(fā)生機(jī)制的研究。

Impact of the suramin on the ability of lymphatic endothelial cells' tube formation induced by tumor supernatant fluid

XU Yong-Liang, SUN Ping, ZHANG Da-Wei，etal.

Department of Anatomy, Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157011, Heilongjiang, China

Abstract【】ObjectiveTo study the impact of the suramin on the tube formation induced by lung cancer Calu-1 cell supernatant.MethodsCell immunofluorescence was applied to test the lymphatic endothelial cells. Matrigel was used to test the ability of lymphatic endothelial cells' tube formation.ResultsSuramin had little effect on lymphatic endothelial cells' proliferation and the ability of tube formation. Tumor supernatant fluid enhanced the ability of tube formation in a dose-dependent, while suramin inhabited this change caused by tumor supernatant fluid in a dose-dependent.ConclusionsTumor supernatant fluid could promote the tube formation of lymphatic endothelial cells, while suramin could inhabit the tube formation of the lymphatic endothelial cells caused by tumor supernatant fluid.

【Key words】Suramin; Lymphatic endothelial cells; Tumor supernatant fluid; Tube formation

淋巴管是人類癌癥發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要途徑。因此，在淋巴結(jié)內(nèi)發(fā)現(xiàn)癌灶是幾乎所有的貌似局限的癌癥預(yù)后不良的重要指標(biāo)。許多的動物模型研究證明，抑制腫瘤局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與控制遠(yuǎn)隔器官轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，說明通過淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)隔器官是腫瘤轉(zhuǎn)移的方式之一〔1〕。Pader等〔2〕的研究認(rèn)為腫瘤自身的淋巴管對于淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生更為重要，腫瘤中央的淋巴管多是無功能的，而腫瘤邊緣的淋巴管對于淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生起著重要作用。近10年來，有關(guān)腫瘤淋巴管生成的大量實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究表明，針對腫瘤淋巴管生成進(jìn)行靶向治療有可能成為最有效地抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的治療策略。本研究采用了肺癌Calu-1細(xì)胞系的上清液誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(LEC)的方法，加入蘇拉明，以此來檢測其對腫瘤淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力的影響。

1材料與方法

1.1淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定實(shí)驗(yàn)方法及鑒定結(jié)果參照文獻(xiàn)〔3〕。

1.2細(xì)胞系肺癌Calu-1細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.3腫瘤上清液的制備取對數(shù)生長期達(dá)到80%融合的腫瘤細(xì)胞，采用無血清的DMEM培養(yǎng)，37℃，5%CO2條件下孵育24 h，然后離心并收集上清液，將以1∶4的比例與DMEM混勻備用。

1.4蘇拉明對LEC管腔形成能力影響的檢測首先收集已貼壁的LEC，然后將收集的LEC以5×105/孔的細(xì)胞密度接種在事先涂有Matrigel的24孔板中，加入不同濃度(0、100、200、400 μg/ml)的蘇拉明后作用48 h后，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察LEC形成管腔的情況。每孔隨機(jī)選取5個視野，并計(jì)數(shù)形成管腔的數(shù)目，計(jì)算平均值。

1.5腫瘤上清液對LEC管腔形成能力影響的檢測首先收集已貼壁的LEC，然后將收集的LEC以5×105/孔的細(xì)胞密度接種在事先涂有Matrigel的24孔板中，分別加入為0%、10%、20%、40%體積分?jǐn)?shù)的腫瘤細(xì)胞上清液，作用48 h后，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察LEC形成管腔的情況。每孔隨機(jī)選取5個視野，并計(jì)數(shù)形成管腔的數(shù)目，計(jì)算平均值。

1.6蘇拉明對腫瘤上清液誘發(fā)的LEC管腔形成能力的影響首先收集已貼壁的LEC，然后將收集的LEC以5×105/孔的細(xì)胞密度接種在事先涂有Matrigel的24孔板中，加入體積分?jǐn)?shù)為40%腫瘤細(xì)胞上清液的DMEM。作用12 h后，再分別加入不同濃度0、100、200、400 μg/ml的蘇拉明后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察LEC形成管腔的情況。每孔隨機(jī)選取5個視野，并計(jì)數(shù)形成管腔的數(shù)目，計(jì)算平均值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.0軟件，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1蘇拉明對LEC管腔形成能力的影響隨著蘇拉明濃度的增加，LEC的管腔形成數(shù)量沒有明顯變化0、100、200、400 μg/ml的蘇拉明作用后，LEC的管腔形成數(shù)量分別為2.333 3±0.816 5，3.133 3±0.516 4，2.566 7±0.169 1，2.666 7±1.211 1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明蘇拉明對LEC管腔形成能力沒有影響。見圖1。

圖1　蘇拉明對LEC的管腔形成能力的影響(×100)

2.2腫瘤上清液對LEC管腔形成能力的影響通過成管實(shí)驗(yàn)研究顯示，隨著腫瘤上清液體積分?jǐn)?shù)的增加，LEC的管腔形成數(shù)量明顯增多，0%、10%、20%、40%體積分?jǐn)?shù)組LEC管腔形成個數(shù)分別為2.333 3±0.816 5，4.333 3±0.516 4，6.166 7±1.169 1，7.666 7±1.211 1。結(jié)果顯示各組間具有顯著差異(P<0.05)，說明腫瘤上清液對LEC管腔形成能力有促進(jìn)作用，呈濃度依賴性。見圖2。

圖2　腫瘤上清對LEC管腔形成能力的影響(×100)

2.3蘇拉明對腫瘤上清液誘發(fā)的LEC管腔形成能力的影響見圖3。通過成管實(shí)驗(yàn)研究顯示，隨著蘇拉明濃度的增加，腫瘤上清液誘發(fā)的LEC的管腔形成數(shù)量逐漸減少，0、100、200、400 μg/ml蘇拉明作用后，LEC管腔形成個數(shù)分別為6.666 7±1.505 5，3.600 0±0.894 4，2.430 0±0.286 8，1.930 0±0.156 0。結(jié)果顯示各組間具有顯著差異(P<0.05)，說明蘇拉明對腫瘤上清液誘發(fā)的LEC管腔形成能力有抑制作用，并呈劑量依賴性。

圖3　蘇拉明對腫瘤上清液誘發(fā)的LEC管腔 形成能力的影響(×100)

3討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤患者致死的主要原因。淋巴管是實(shí)體腫瘤轉(zhuǎn)移的最早通路之一，也是影響預(yù)后的重要因素。研究表明，腫瘤周圍區(qū)的淋巴管有數(shù)量上的改變，增加了腫瘤細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)會。鑒于腫瘤淋巴管生成在腫瘤轉(zhuǎn)移(尤其淋巴道轉(zhuǎn)移)及腫瘤細(xì)胞代謝過程中起著極其重大的作用，研發(fā)和應(yīng)用淋巴管生成抑制劑對抑制腫瘤的局部淋巴管生成意義重大。通過抑制腫瘤的局部淋巴管生成，阻斷了腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移途徑，可以使腫瘤病患病情惡化的概率降低，生活質(zhì)量得到提升，最終達(dá)到延長病患生存期的目的。當(dāng)前，隨著對腫瘤淋巴管生成機(jī)制的深入研究，抗淋巴管生成治療逐步成為抗腫瘤治療中一個新的研究方向。

蘇拉明作為抗腫瘤藥已經(jīng)作用于臨床〔4～6〕。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用蘇拉明抗腫瘤效果較為明顯，蘇拉明與其他抗腫瘤藥還具有協(xié)同作用。蘇拉明不但能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，而且能夠通過阻斷生長因子(如VEGF、TGF、PDGF、IGF等)與其受體的相互作用，抑制腫瘤血管的生成〔7〕，達(dá)到減少腫瘤組織營養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤生長。然而，蘇拉明對腫瘤細(xì)胞誘發(fā)的腫瘤淋巴管生成，特別是蘇拉明對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和管腔形成能力的影響卻未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過腫瘤上清液作用于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞模擬體內(nèi)腫瘤狀態(tài)下的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞狀態(tài)，進(jìn)而觀察蘇拉明對腫瘤上清液誘導(dǎo)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力的影響。結(jié)果表明，隨著腫瘤上清液體積分?jǐn)?shù)的增加，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成能力逐漸增強(qiáng)。這表明腫瘤細(xì)胞可能是通過釋放一些細(xì)胞營養(yǎng)因子這種方式來改變淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)，從而影響其功能。同時，也發(fā)現(xiàn)蘇拉明能抑制這種腫瘤上清液誘發(fā)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞管腔的形成，而蘇拉明對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成則沒有明顯影響。這些結(jié)果說明蘇拉明可能通過阻斷由腫瘤細(xì)胞所引起的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞活性增強(qiáng)從而達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

當(dāng)然蘇拉明對淋巴管內(nèi)皮管腔形成能力的影響是否還有其他作用機(jī)制，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。本實(shí)驗(yàn)只是初步的細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，有待進(jìn)一步的深入研究及動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4參考文獻(xiàn)

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3徐永良.蘇拉明對腫瘤上清液誘導(dǎo)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響〔J〕.牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013;1：3-5.

4Kawakami M，F(xiàn)uruhata T，Kimura Y，etal.Quantification of vascular endothelial growth factor-C and its receptor-3 messenger RNA with real-time quantitative polymerase chain reaction as a predictor of lymphnode metastasis in human colorectal cancer〔J〕．Surgery，2003;133(3)：300-8.

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6王海東，景濤，楊康,等.蘇拉明對食管癌血管生成抑制作用研究〔J〕.消化外科，2005;4(1)：59-61.

7Hall FT，F(xiàn)reeman JL，Asa SL，etal.Intratumoral lymphatics and lymph node metastases in papillary thyroid carcinoma〔J〕.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2003;129(7)：716-9.

〔2015-04-15修回〕

(編輯曲莉)