醫(yī)院檢出陰溝腸桿菌耐藥性及耐藥基因

方先松1焦會(huì)園溫小云2宋礦余王力薇李蓉

(南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，江西南昌330066)

摘要〔〕目的了解臨床分離陰溝腸桿菌耐藥性與耐藥基因情況，為臨床合理選用抗菌藥物提供理論依據(jù)。方法收集贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床分離的陰溝腸桿菌40株，瓊脂稀釋法與紙片擴(kuò)散法檢測(cè)常用抗菌藥物的敏感性，采用PCR方法對(duì)12種耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。將該院檢出的40株陰溝腸桿菌作為研究樣本，采用瓊脂稀釋法與紙片擴(kuò)散法行藥敏試驗(yàn)，而后采用序列分析法與PCR(聚合酶反應(yīng))對(duì)12種耐藥相關(guān)基因進(jìn)行分析。結(jié)果經(jīng)分析后的藥物敏感結(jié)果顯示，40株陰溝腸桿菌標(biāo)本對(duì)頭孢吡肟耐藥率以15.0%為最低，而對(duì)美羅培南與亞胺培南敏感率均為100%，其他抗菌耐藥率范圍為42.0%～92.5%；耐藥基因共8類(lèi)，分別為sull、Int I 1、aac(3，')-I、AmpC、CTX-M-9、CTX-M-3、SHV-2a、TEM-1，sull+Int I 1為大部分菌株所攜帶；耐藥譜分為9型(A-I)，其中以A、D占比較高，且基因分型與其分型存在一定的相關(guān)性。結(jié)論陰溝腸桿菌有高度與多重耐藥性特征，其耐藥機(jī)制較為復(fù)雜且為多種耐藥機(jī)制共同作用。

關(guān)鍵詞〔〕醫(yī)院感染；陰溝腸桿菌；耐藥性；耐藥基因

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

通訊作者：李蓉(1973-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事細(xì)菌耐藥與感染免疫的研究。

1贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

2贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院輸血科

第一作者：方先松(1981-)，男，副主任技師，主要從事生化免疫微生物方面研究。

陰溝腸桿菌為臨床上較為常見(jiàn)的致病菌，屬腸桿菌科，當(dāng)前，隨著臨床廣譜抗菌藥物(如第三代與第四代碳青霉烯類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)以及氟喹諾酮類(lèi)藥物等)的不斷推廣與應(yīng)用，陰溝腸桿菌耐藥現(xiàn)象日漸嚴(yán)重，為臨床疾病的治療帶來(lái)了難度〔1〕。本文對(duì)我院檢出的40株陰溝腸桿菌標(biāo)本采用細(xì)菌藥敏試驗(yàn)與分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行了基因檢測(cè)。

1資料與方法

1.1一般資料將我院2013年檢出的40株陰溝腸桿菌標(biāo)本作為研究樣本。樣本來(lái)源：14份創(chuàng)傷創(chuàng)面分泌物，3份痰液，8份燒傷創(chuàng)面分泌物，6份靜脈血，6份潰瘍分泌物，膿液、竇道分泌物以及腦脊液各1份。菌種的鑒定采用VITEK-2 compact全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏分析儀，質(zhì)控菌種為ATCC 27853與ATCC 25922。

1.2方法

1.2.1抗菌藥物敏感性檢測(cè)分離出40株陰溝腸桿菌采用K-B法(紙片擴(kuò)散法)對(duì)抗菌藥物的敏感性進(jìn)行測(cè)定，采用瓊脂稀釋法檢測(cè)抗菌藥物最低抑菌濃度MIC50、MIC90。結(jié)果判斷參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)CLSIM100-S24(2014年)〔2〕，用敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)報(bào)告。藥敏紙片均為英國(guó)Oxoid公司生產(chǎn)，具體如下：阿莫西林(AMX)、阿莫西林/克拉維酸(AMC)、替卡西林/克拉維酸(TIM)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢噻吩(CEF)、頭孢唑林(CFZ)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢曲松(CRO)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢哌酮/舒巴坦(CFS)、頭孢西丁(FOX)、亞胺培南(IPM)、美羅培南(MEM)、妥布霉素(TOB)、阿米卡星(AMK)、左氧氟沙星(LVX)、復(fù)方磺胺甲口惡唑(SXT)、頭孢他啶/克拉維酸(CDO2)、頭孢噻肟/克拉維酸(CDO3)。

1.2.2耐藥基因檢測(cè)耐藥基因采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)〔3〕進(jìn)行檢測(cè)，即先以煮沸法制備DNA擴(kuò)增模板，耐藥基因共12種，其中β-內(nèi)酰胺酶基因8種：blaSHV-2a、blaTEM-1、blaCTX-M-9、blaCTX-M-3、blaCTX-M-2、AmpC、PRE-1、VEB-1；氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因(AMEs)2種：aac(3，')-I、aac(6，')-I；磺胺耐藥相關(guān)基因(sull)與Ⅰ類(lèi)整合酶基因(Int I 1)各1種。上述引物均以已發(fā)布的各型基因序列設(shè)計(jì)；將純水作為陰性對(duì)照；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，并于紫外凝膠成像儀下做好觀察與記錄。

1.3序列測(cè)定與分析當(dāng)擴(kuò)增陽(yáng)性基因PCR產(chǎn)物經(jīng)純化作用后，采用雙脫氧末端終止法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在PUBMED的BLAST程序中行同源性分析。

2結(jié)果

2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果情況40株陰溝腸桿菌標(biāo)本對(duì)FEP耐藥率以15.0%為最低，而對(duì)MEM、IPM敏感率均為100%，其他抗菌耐藥率范圍為42.0%～92.5%，見(jiàn)表1。

2.2耐藥譜分型情況40株菌株中共檢出基因?yàn)?種，其耐藥譜分為9型(A-I)，其中以A、D占比較高，且基因分型與其分型存在一定的相關(guān)性，見(jiàn)表2。

2.3基因檢測(cè)結(jié)果情況經(jīng)基因檢測(cè)后的結(jié)果顯示，基因分型及其同源菌株情況見(jiàn)表3。

表1　藥敏試驗(yàn)結(jié)果情況

中介視為耐藥

表2　耐藥譜分型情況

R表示耐藥；S表示敏感

表3　基因檢測(cè)結(jié)果情況

2.4本次序列分析情況超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因CTX-M-3組取33號(hào)與2號(hào)菌株測(cè)序列，均為亞型；SHV-2a組取25、21、16、8號(hào)菌株進(jìn)行測(cè)試，均為SHV-2a；AmpC組取18、12、10、5號(hào)菌株進(jìn)行測(cè)序，其與AmpC酶核苷酸序列(AF411149)99%同源；TEM-1組則取37--27、21、13、3號(hào)菌株進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果均為T(mén)EM-1亞型；sull組取5、4、3、2號(hào)菌株測(cè)序，結(jié)果均為sull；aac(3，')-I組取40、33、32、14號(hào)菌株進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果均為aac(3，')-I。圖1為本次序列基因PCR擴(kuò)增電泳示意圖。

M：DNA Marker DL 2000，1～19；陰溝腸桿菌；+：陽(yáng)性對(duì)照；-：陰性對(duì)照 圖1　本次序列基因PCR擴(kuò)增電泳示意圖

3討論

陰溝腸桿菌在醫(yī)院感染中較為常見(jiàn)，當(dāng)前，隨著多重耐藥現(xiàn)象的日漸加重，臨床上常用的抗菌藥物耐藥率呈現(xiàn)出不斷提高態(tài)勢(shì)〔3，4〕。本研究認(rèn)為臨床上針對(duì)產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌者可給予其FEP，而IPM等碳青霉烯類(lèi)抗生素對(duì)所分離出的陰溝腸桿菌的抗菌活性較高，可有效發(fā)現(xiàn)耐藥株，因而廣泛耐藥重癥感染者治療過(guò)程中可將其作為首選治療藥物，但應(yīng)注意慎重使用，避免篩選或誘導(dǎo)出可耐藥菌株，進(jìn)而防止其出現(xiàn)播散，對(duì)治療造成惡劣影響〔5〕。

陰溝腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的主要耐藥機(jī)制為產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，其中以ESBLs、AmpC酶以及MBL(碳青霉烯酶)最為常見(jiàn)。本研究中，12種β-內(nèi)酰胺酶基因中有5種出現(xiàn)了擴(kuò)增陽(yáng)性，分別為blaSHV-2a、blaTEM-1、blaCTX-M-9、blaCTX-M-3、AmpC酶基因，且僅研究后的結(jié)果顯示，blaTEM基因具有相當(dāng)高攜帶率，占比為45%，測(cè)序后的結(jié)果顯示其為T(mén)EM-1亞型；blaSHV基因攜帶率為30.0%，測(cè)序后的結(jié)果顯示其為SHV-2a；AmpC酶基因檢出率為35.0%；blaCTX-M-9基因攜帶率為5.0%，

期間見(jiàn)4株產(chǎn)AmpC酶與ESBLs酶菌，產(chǎn)SHV與TEM基因10株，且當(dāng)均菌株中的SHV與TEM型ESBLs同時(shí)存在或AmpC酶與ESBLs同時(shí)表達(dá)時(shí)，耐藥表型便會(huì)較為復(fù)雜，因而可加大治療難度〔6〕。經(jīng)檢測(cè)后的結(jié)果顯示，陰溝腸桿菌之所以對(duì)第三代頭孢菌素耐藥，其主要與AmpC酶與ESBLs型β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)，本研究表明陰溝腸桿菌中的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥相關(guān)基因類(lèi)型存在較大的差別。近年來(lái)，細(xì)菌移動(dòng)性遺傳元件發(fā)現(xiàn)，Ⅰ類(lèi)整合子耐藥基因盒中攜帶的二氫葉酸合成酶編碼基因Sull陽(yáng)性提示對(duì)磺胺類(lèi)藥物可耐受〔7〕，本研究中，Sull基因陽(yáng)性率為90.0%，磺胺耐藥基因檢出率或與人們過(guò)多使用消毒劑，進(jìn)而推動(dòng)了細(xì)菌耐消毒劑基因進(jìn)程，導(dǎo)致院內(nèi)感染，而其基因同源菌株的存在，則在很大程度上表明其感染流行的可能性較小〔8〕。

綜上所述，陰溝腸桿菌有高度與多重耐藥性特征，其耐藥機(jī)制較為復(fù)雜且為多種耐藥機(jī)制共同作用，與耐藥特征復(fù)雜、耐藥譜廣存在較大的關(guān)聯(lián)，故而我們應(yīng)采取相應(yīng)的措施以降低醫(yī)源性感染的發(fā)生，并做好細(xì)菌培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)工作，聯(lián)合做好醫(yī)院感染監(jiān)測(cè)工作，以降低陰溝腸桿菌醫(yī)院感染率。

4參考文獻(xiàn)

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8Wang YC，Zheng GY,Yang J,etal.Lower respiratory tract infections sewer enterobacter pop and resistance analysis〔J〕.China Lab Dia，2012;(4)：628-30.

〔2014-10-22修回〕

(編輯李相軍)

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