慢性炎癥狀態(tài)下成纖維細胞生長因子23與終末期腎病血管鈣化的相關性

張藝馬玲1肖業(yè)偉2余廣2馮志強2盤強文2

(瀘州醫(yī)學院機能實驗室，四川瀘州646000)

摘要〔〕目的探討炎癥狀態(tài)下成纖維細胞生長因子(FGF)23與終末期腎病(ESRD)血管鈣化的關系。方法成年雄性SD大鼠隨機分為對照組(Ctr)組、慢性腎功能不全(CRF)組和炎癥伴慢性腎功能不全(CRF+I)組。Ctr組用生理鹽水灌胃持續(xù)6 w，CRF組用腺嘌呤灌胃持續(xù)6 w構建大鼠CRF的動物模型，CRF+I組每天用腺嘌呤灌胃持續(xù)6 w并隔日皮下注射10%酪蛋白(Casein，1.2 g/kg)構建大鼠炎癥伴CRF動物模型。檢測各組血清肌酐、尿素氮、磷以及血管組織的鈣含量、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)蛋白表達量、FGF23 mRNA表達水平等指標。結果α-SMA 蛋白表達量，Ctr組明顯高于CRF組和CRF+I組(P<0.05)，CRF組明顯高于CRF+I組(P<0.05)；組織鈣含量，CRF組和CRF+I組明顯高于Ctr組(P<0.05)，而CRF+I組明顯高于CRF組(P<0.05)；FGF23 mRNA表達，CRF+I組的相對表達量明顯高于CRF和Ctr組(P<0.05)，Ctr組和CRF組FGF23 mRNA的相對表達量無差異(P>0.05)。結論炎癥除了可以直接引起ESRD血管鈣化外還可以通過升高FGF23加劇ESRD血管鈣化。

關鍵詞〔〕終末期腎??；血管鈣化；炎癥；成纖維細胞生長因子23

中圖分類號〔〕R692.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：四川省教育廳項目(09ZC118)

通訊作者：盤強文(1971-)，男，教授，碩士生導師，主要從事腎功能保護研究。

1漯河醫(yī)學高等專科學校生理學教研室

2瀘州醫(yī)學院腎功能保護研究室

第一作者：張藝(1981-)，女，實驗師，碩士，主要從事腎功能保護研究。

終末期腎病(ESRD)患者心血管疾病發(fā)病率及病死率的增加與患者的血管鈣化密切相關，而有研究表明高磷血癥是慢性腎功能不全(CRF)患者血管鈣化的重要誘因，與心血管死亡事件亦密切相關〔1〕。成纖維細胞生長因子(FGF)23目前普遍認為能通過作用于腎臟和抑制1α-羥化酶的表達和活性以達到降低血磷的作用。有學者〔2〕觀察到FGF23也可能參與了CRF患者的血管鈣化。同時終末期腎病(ESRD)患者體內(nèi)存在微炎癥狀態(tài)并可能參與血管鈣化的形成〔3〕。而ESRD患者的慢性炎癥狀態(tài)與FGF23是否存在關系則未見報道。本實驗檢測慢性炎癥條件下CRF大鼠的血清磷、肌酐、尿素氮以及血管組織鈣含量、血管平滑肌α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)蛋白表達量和FGF23 mRNA表達水平，探討慢性炎癥狀態(tài)下FGF23與ESRD血管鈣化的相關性。

1材料與方法

1.1材料與試劑腺嘌呤、酪蛋白(Casein)、硫代硫酸鈉、硝酸銀、核固紅購自武漢博士德生物工程公司，血磷、血尿素氮和血肌酐試劑盒購自南京建成生物工程研究所，RNA提取試劑盒購自天根生物技術有限公司，RT-PCR試劑盒購自成都博瑞克生物技術有限公司，SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，單克隆小鼠抗α-SMA抗體購自武漢博士德生物工程公司。

1.2動物分組及模型制備8 w齡成年雄性SD大鼠30只，體重(200±20)g，由瀘州醫(yī)學院實驗動物中心提供。隨機分為對照組(Ctr，n=6)、CRF組(n=12)、CRF+炎癥組(CRF+I，n=12)。Ctr組用生理鹽水(10 ml/kg)灌胃，另兩組用腺嘌呤(300 mg/kg)灌胃構建大鼠CRF動物模型，其中CRF+I組隔日以10% Casein(1.2 g/kg)皮下注射。6 w后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后取材備檢。

1.3取材及指標檢測首先經(jīng)腹主動脈取血用于測定血清肌酐、尿素氮和磷等指標，按試劑盒說明操作。然后分離并摘取腹主動脈，部分用 4%中性甲醛固定后做組織學觀察，余下主動脈作鈣定量及PCR檢測基因表達等。血管組織按SP免疫組化試劑盒處理后用DAB顯色液顯色在光鏡下隨機觀察5個視野，用Image Pro Plus 6.0軟件進行半定量分析被檢血管組織中α-SMA的陽性表達量；用Von Kossa染色觀察血管組織鈣沉積；以OCPC法檢測血管組織鈣濃度；用RT-PCR法擴增FGF23以測定血管組織中FGF23 mRNA的轉錄水平，反應條件為：94℃2 min，94℃30 s→ Tm℃30 s→ 72℃1 min，熱循環(huán)30次，72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后進行圖像分析。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及LSD法(最小顯著差異法)。

2結果

2.1三組肌酐和尿素氮測定及動物模型構建結果各組肌酐比較，CRF組(270.93±29)μmol/L和CRF+I組(270.63±24.54)μmol/L比Ctr組(66.85±1.5)μmol/L明顯升高(P<0.05)；各組尿素氮比較，CRF組(27.9±4.1)mmol/L和CRF+I組(33.65±8.26)mmol/L比Ctr組(6.62±0.28)mmol/L明顯升高(P<0.05)，CRF模型構建成功，CRF+I組使用連續(xù)6 w隔日皮下注射10% Casein(1.2 g/kg)的方法構建慢性炎癥模型。

2.2炎癥對CRF大鼠血清磷的影響CRF組(5.23±0.27)mmol/L及CRF+I組(5.37±0.42)mmol/L磷濃度均明顯高于Ctr組(2.1±0.2)mmol/L(P<0.05)，CRF組和CRF+I組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3各組大鼠血管平滑肌細胞中α-SMA的陽性表達量α-SMA蛋白陽性表達呈淡黃色或棕色，定位于細胞質(zhì)中。Ctr組α-SMA 蛋白表達量(0.16±0.01)明顯高于CRF組(0.13±0.01)和CRF+I組(0.08±0.04)(P<0.05)，CRF組α-SMA 蛋白表達量明顯高于CRF+I組(P<0.05)。見圖1。

圖1　各組大鼠血管平滑肌細胞α-SMA陽性表達(DAB，×400)

2.4各組大鼠主動脈組織Von Kossa染色結果Ctr組和CRF組內(nèi)皮細胞排列完整，彈性纖維無斷裂，平滑肌排列整齊，未見黑色鈣鹽沉積，核固紅復染為粉紅色；CRF+I組平滑肌排列紊亂，部分彈性纖維斷裂，中膜彈力層可見廣泛分布的黑色鈣鹽沉積，間或聚集成團。見圖2。

箭頭所指為鈣鹽沉積 圖2　大鼠胸主動脈Von Kossa染色結果(×200)

2.5大鼠動脈組織中鈣含量變化CRF+I組(258.98±69.50)μmol/g動脈組織中鈣含量高于CRF組(107.55±32.50)μmol/g和Ctr組(23.66±11.54)μmol/g(P<0.05)，CRF組動脈組織中鈣含量高于Ctr組(P<0.05)。

2.6炎癥對CRF大鼠血管組織中FGF23 mRNA表達水平的影響CRF+I組(0.86±0.35)FGF23 mRNA的相對表達量均高于Ctr組(0.24±0.29)和CRF組(0.3919±0.33)(P<0.05)。Ctr和CRF組FGF23mRNA的相對表達量無差異(P>0.05)。見圖3。

1、4：Ctr組，2、5：CRF組，3、6：CRF+I組 圖3　FGF23 mRNA電泳結果

3討論

本實驗結果顯示ESRD大鼠動脈組織Von Kossa鈣染色和鈣含量，CRF+I 組最高，CRF組次之，Ctr組最低，而動脈組織免疫組化結果顯示，各組α-SMA蛋白表達量的差異則剛好相反，提示在ESRD時，炎癥可作為一項獨立的影響因素促進血管平滑肌細胞的轉分化和鈣化的進程，其可能機制：慢性炎癥一方面促使細胞產(chǎn)生炎性因子，進而促進成骨細胞分化和增殖，另一方面刺激肝臟急性時相蛋白的合成同時減少Fetuin-A的合成。Fetuin-A作為血管鈣化的主要循環(huán)系統(tǒng)抑制因子，它通過刺激吞噬細胞吞噬凋亡物質(zhì)，抑制羥磷灰石的生成〔4〕。Fetuin-A的減少會造成血管內(nèi)皮細胞紊亂和氧化應激等。

在慢性炎癥和ERSD繼發(fā)的高磷血癥條件下骨形態(tài)蛋白(BMP)-2的表達增加。BMP-2與平滑肌細胞膜上的BMP-2受體結合，誘導一系列Smads的核內(nèi)轉移和磷酸化〔5〕，將信號轉移到細胞核內(nèi)，進而上調(diào)Cbfα-1等特異性成骨基因的轉錄活性，使平滑肌細胞表達成骨/成軟骨細胞表型。BMP-2表達增加，促使其下游基因Msx2表達上調(diào)，增進Wnt3a的表達，使經(jīng)典的Wnt3a/β連環(huán)信號通路加強〔6〕，從而抑制平滑肌細胞向脂肪細胞和軟骨細胞分化，使其向成骨細胞分化、增殖并促使礦物質(zhì)沉積增加而促進鈣化的發(fā)生。

FGF23是重要的調(diào)磷因子，其作用的主要靶器官是腎臟。ESRD患者體內(nèi)普遍存在高磷血癥，血磷水平升高促進成骨細胞表達FGF23增加，F(xiàn)GF23通過血液循環(huán)到達腎臟作用于腎臟近曲小管，抑制NaPi-Ⅱ的表達減少磷的重吸收降低血磷；FGF23也可通過抑制1α-羥化酶的表達和活性，使1，25(OH)2D3生成減少，從而抑制腸道對磷的吸收實現(xiàn)機體穩(wěn)定的血磷環(huán)境〔7〕。本實驗提示此時FGF23表達增加不是由血清磷增高引起，而可能是由炎癥刺激導致。

FGF23水平不僅是礦物質(zhì)代謝異常引起的早期心血管病變的生物標志，有研究觀察到，血液透析患者血漿FGF23水平的增加與主動脈鈣化獨立相關〔8〕。也有學者對其是否直接作用于心血管系統(tǒng)，導致心血管病變提出質(zhì)疑〔9〕。最近還有報道在頸動脈不穩(wěn)定斑塊的平滑肌細胞發(fā)現(xiàn)FGF23及受體I的過表達〔10〕。本實驗結果顯示CRF+I 組血管組織鈣含量明顯高于CRF組，而CRF+I 組血管組織FGF23 mRNA表達量明顯高于CRF組。由此推測，炎癥刺激下高表達的FGF23與其受體結合后可能加劇動脈中膜平滑肌細胞鈣化。

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〔2014-06-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)