左乙拉西坦對(duì)癲癇大鼠海馬組織中5-HT2A受體表達(dá)及其認(rèn)知功能的影響

聶磊張濤1王海燕鄒艷紅王影李春玉王禹遲瑛嬌趙塔娜趙冬梅

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002)

摘要〔〕目的探討左乙拉西坦(LEV)對(duì)癲癇大鼠海馬組織中5-羥色胺2A(5-HT2A)受體動(dòng)態(tài)表達(dá)及對(duì)認(rèn)知功能的影響。方法108只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(NS)24只、正常給藥組(LEV)24只、癲癇模型組(Li-PILO)30只、癲癇給藥組(Li-PILO+LEV)30只，分別給予LEV組和Li-PILD+LEV組大鼠LEV 200 mg/kg 1次/d灌胃，連續(xù)28 d。采用RT-PCR方法分別在第7、14、28天動(dòng)態(tài)檢測(cè)大鼠海馬組織中5-HT2A受體的表達(dá)，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶。結(jié)果LEV與NS組5-HT2A受體表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NS組比較，Li-PILO組在第7天時(shí)表達(dá)水平降低，且隨時(shí)間延長(zhǎng)降低水平越明顯，即在第14、28天5-HT2A受體表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與Li-PILO型組比較，Li-PILO+LEV組5-HT2A受體在第7、14、28天表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組的逃避潛伏期明顯縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加(均P<0.05)。結(jié)論LEV的抗癲癇作用可能與通過(guò)上調(diào)5HT-2A受體的表達(dá)有關(guān)，其在抗癲癇的同時(shí)還可以改善大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶。

關(guān)鍵詞〔〕左乙拉西坦；癲癇；5-羥色胺2A受體；氯化鋰-匹羅卡品

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R742.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(No.2013-230)

通訊作者：張濤(1964-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事抗腫瘤與抗衰老的研究。

1佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

第一作者：聶磊(1977-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

癲癇是兒科常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一〔1，2〕。許多抗癲癇藥物會(huì)使患兒的認(rèn)知功能受到不同程度的損害，因此需要尋求一種既有抗癲癇作用又有腦保護(hù)作用的抗癲癇藥物。左乙拉西坦(LEV)抗癲癇機(jī)制獨(dú)特，通過(guò)與中樞神經(jīng)元突觸囊泡蛋白結(jié)合而達(dá)到抗癲癇作用。LEV與突觸囊泡蛋白有很高的結(jié)合能力，結(jié)合后可以與抑制神經(jīng)元異常放電，從而發(fā)揮抗癲癇的作用〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，LEV對(duì)于治療多種癲癇發(fā)作類(lèi)型有顯著效果并有改善認(rèn)知功能的作用〔4，5〕。本課題通過(guò)建立氯化鋰-匹羅卡品(Li-PILO)癲癇大鼠模型，初步探討LEV對(duì)癲癇大鼠海馬組織中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和5-羥色胺2A(5-HT2A)受體表達(dá)及學(xué)習(xí)記憶功能的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組108只清潔級(jí)的Wistar大鼠(由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重(90±10)g，隨機(jī)分為對(duì)照組(NS)24只、正常給藥(LEV)24只、癲癇模型組(Li-PILO)30只、癲癇給藥組(Li-PILO+LEV)30只。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑和癲癇模型建立Li-PILO(Sigma公司)，LEV(UCB S.A.Belgim公司)，RT-PCR試劑盒和引物合成(北京華邁科生物技術(shù)有限公司)。動(dòng)物模型的建立過(guò)程參照相關(guān)文獻(xiàn)〔6〕并稍有改進(jìn)，將Li-PILO組及Li-PILO+LEV組大鼠先腹腔注射氯化鋰120 mg/kg，20 h后，再腹腔注射東莨菪堿1 mg/kg拮抗外周膽堿能反應(yīng)，30 min后再次腹腔注射皮羅卡品80 mg/kg，并觀察大鼠的行為。大鼠的癲癇發(fā)作分級(jí)參照RACINE分級(jí)，0級(jí)：無(wú)反應(yīng)或抽搐停止；Ⅰ級(jí)：面部抽動(dòng)、咀嚼；Ⅱ級(jí)：面部抽動(dòng)、咀嚼、點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)：面部抽動(dòng)、咀嚼、點(diǎn)頭、前肢或后肢抽動(dòng)；Ⅳ級(jí)：面部抽動(dòng)、咀嚼、點(diǎn)頭、前肢或后肢抽動(dòng)、多肢抽動(dòng)或強(qiáng)直；Ⅴ級(jí)：全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作。在大鼠癲癇發(fā)作30 min后，立即腹腔注射地西泮(10 mg/kg)終止癲癇發(fā)作。Li-PILO+LEV組在成功建立模型后的4 h給予LEV 200 mg/kg，1次/d，連續(xù)28 d，動(dòng)態(tài)觀察并分別于第7、14、28天提取海馬組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)將4組大鼠于癲癇模型建立7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，共持續(xù)4 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：于第5天進(jìn)行，撤去平臺(tái)，將大鼠于水池中任意一點(diǎn)放入水中游泳，記錄大鼠60 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.4RT-PCR法檢測(cè)大鼠海馬組織中5-HT2A受體的表達(dá)模型建立7、14、28 d后，分別將4組大鼠給予10%水合氯醛(0.1 ml/kg)麻醉后固定，斷頭取出海馬組織并立即放在液氮中保存。海馬組織勻漿后，加入Trizol液提取mRNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA產(chǎn)物進(jìn)行Real-time PCR循環(huán)。從NCBI庫(kù)中搜索到5-HT2A受體應(yīng)用Premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。5-HT2A上游引物：5′GGTTTCCTT-GTCATGCCTGT 3′，下游：5′TGCAGGATTCTTTGCAGATG 3′；內(nèi)參GAPDH上游：5′TGCTTCACCACCTTCTTGA 3′，下游：5′TCACCATCTTCCAGGAGCG 3′。擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析、單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1觀察大鼠行為學(xué)表現(xiàn)匹羅卡品腹腔注射約5～10 min后，Li-PILO組和Li-PILO+LEV組大鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作，表現(xiàn)為面部抽動(dòng)、點(diǎn)頭、洗臉、前肢陣攣、跌倒以至全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作，其中Li-PILO組和Li-PILO+LEV組共有9只大鼠抽搐后死亡，癲癇發(fā)作30 min后立即給予地西泮(10 mg/kg)腹腔注射終止發(fā)作，在大鼠成功建立模型后Li-PILO組和Li-PILO+LEV組大鼠表現(xiàn)出易激惹，并可觀察到Ⅰ～Ⅳ級(jí)的癲癇發(fā)作。

2.2LVE對(duì)認(rèn)知功能的影響在定位航行實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，Li-PILO組的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；Li-PILO組與Li-PILO+LEV組比較，Li-PILO+LEV組的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)；LEV組和NS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，Li-PILO組穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少(P<0.05)；與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增多(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1　LEV對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響

與Li-PILO組比較：1)P<0.05

2.3各組大鼠海馬組織中5-HT2A受體的表達(dá)NS組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)5-HT2A受體表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NS組比較，Li-PILO組在第7天時(shí)大鼠海馬組織中5-HT2A受體表達(dá)水平降低，且隨時(shí)間延長(zhǎng)5-HT2A受體表達(dá)水平明顯降低，即在第14、28天，5-HT2A受體表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組5-HT2A受體在第7、14、28天表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖1。

表2　海馬組織中5-HT2A受體相對(duì)表達(dá)量的

與NS組比較:1)P<0.05；與Li-PILO組比較:2)P<0.05

A：Li-PILO+LEV組；B：Li-PILO組；C：NS組；D：LEV組 圖1　PCR檢測(cè)第14天各組大鼠海馬組織中5-HT2A受體表達(dá)

3討論

癲癇是小兒時(shí)期常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，其特點(diǎn)是自發(fā)、慢性、短暫、反復(fù)發(fā)作。癲癇可引起患兒的人格障礙、記憶力減退、智力低下等表現(xiàn)，尤其是在患兒的發(fā)育早期影響較大〔7〕。

5-羥色胺(5-HT)是一種吲哚衍生物，是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其主要的作用有參與記憶和學(xué)習(xí)、情緒、食欲、體溫調(diào)節(jié)、心血管功能、睡眠控制、性和致幻行為、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和抑郁以及肌肉收縮等生理功能〔8〕。5-HT2A受體是5-HT受體的亞型之一。有研究報(bào)道5-HT2A受體與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，Berg等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受損時(shí)腦組織中5-HT2A受體數(shù)目明顯減少。然而目前關(guān)于5-HT2A受體與癲癇的關(guān)系國(guó)內(nèi)外暫無(wú)報(bào)道，而關(guān)于5-HT與癲癇的關(guān)系報(bào)道很多，5-HT在含有抑制性遞質(zhì)γ氨基丁酸的神經(jīng)元上表達(dá)，從而激活γ氨基丁酸，間接地發(fā)揮其抗癲癇作用。本研究提示5-HT2A受體與癲癇有密切的關(guān)系，LVE的抗癲癇機(jī)制可能是通過(guò)升高5-HT2A的表達(dá)而發(fā)揮其抗癲癇作用。認(rèn)知功能包括了學(xué)習(xí)和記憶的過(guò)程。海馬是哺乳動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)，其損傷會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶的障礙。癲癇發(fā)作會(huì)損傷海馬，LEV可治療癲癇，控制癲癇發(fā)作，減少海馬損傷，改善學(xué)習(xí)記憶。LEV作為治療小兒癲癇的藥物，對(duì)認(rèn)知功能無(wú)影響，是一種療效好、安全性好的廣譜抗癲癇藥。何繪敏等〔10〕在左乙拉西坦對(duì)幼年癲癇大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響中發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，LEV組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短，LEV能夠改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在定位航行實(shí)驗(yàn)中癲癇模型組的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，以上的結(jié)果顯示LEV對(duì)癲癇大鼠的認(rèn)知功能有一定的改善作用，LEV對(duì)正常大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力無(wú)損害作用，是安全性很好的抗癲癇藥物。

4參考文獻(xiàn)

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10何繪敏，路晴，孫香梅，等.左乙拉西坦對(duì)幼年癲癇大鼠空間學(xué)習(xí)記憶及海馬膠質(zhì)原纖維酸性蛋白的影響〔J〕.兒科藥學(xué)雜志，2011；17(4)：9-12.

〔2014-05-22修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)