尹　劍　董　蕾

PPARγ、NFkB P65在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜組織中的表達(dá)及意義

尹劍董蕾※

【摘要】目的探討過氧化物酶增殖物激活受體(PPARγ)、核轉(zhuǎn)錄因子-kB p 65(NFkB p65)在潰瘍性結(jié)腸炎(UC)小鼠腸黏膜組織中的表達(dá)及意義。方法20只健康雄性小鼠，隨機(jī)分為模型組和對照組，各10只，模型組小鼠自由飲用5%葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶液，連續(xù)7天，對照組小鼠自由飲用生理鹽水7天。造模成功后處死小鼠，取同水平段結(jié)腸組織，以免疫組化法觀察兩組小鼠黏膜形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)行疾病活動指數(shù)(DAI)評分及病理組織學(xué)分級，并檢測PPARγ和NF-κB p65表達(dá)水平。結(jié)果模型組小鼠DAI評分為8.42±1.13分，對照組DAI評分為0.47±0.23分，組間差異顯著(P<0.01)。PPARγ和NF-κB主要表達(dá)于上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中，對照組可見大量PPARγ陽性細(xì)胞，NF-κB陽性細(xì)胞較少，模型組PPARγ陽性細(xì)胞較少，可見大量NF-κB陽性細(xì)胞。模型組小鼠病理分級越嚴(yán)重，PPARγ表達(dá)水平越低，NF-κB表達(dá)水平越高，兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論P(yáng)PARγ和NFkB P65可能參與UC小鼠炎癥的發(fā)生發(fā)展，聯(lián)合檢測其表達(dá)水平有助于判定病情嚴(yán)重性。

【關(guān)鍵詞】過氧化物酶增殖物激活受體核轉(zhuǎn)錄因子-kB潰瘍性結(jié)腸炎免疫組化

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是發(fā)生于結(jié)腸黏膜的慢性非特異性炎癥，呈反復(fù)發(fā)作特征，目前其確切病因尚不明缺，可能與遺傳因素、免疫及腸道菌群等多因素相互作用有關(guān)[1]。過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)是由配體激活的一類核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員, 包括α，β/δ和γ三種表型，其被配體激活后可調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄[2]。研究表明，PPARγ在UC患者腸黏膜組織中表達(dá)低于正常對照人群[3，4]，且隨著病理分級的增加，PPARγ的陽性表達(dá)率也逐步下降[5]。核轉(zhuǎn)錄因子-kB(NFkB)是調(diào)控UC炎癥反應(yīng)的重要因子，由p50、p52、p65等組成，其中NFkB p65在UC活動期患者腸黏膜組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。本研究通過建立UC小鼠模型，觀察腸黏膜組織中PPARγ和NF-κB p65的表達(dá)，探討UC可能的發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)動物健康BALB/c小鼠20只，雄性，體質(zhì)量18～20g，7～8周齡，由陜西省動物研究所提供。

1.2主要試劑葡聚糖硫酸鈉(DSS)，購自美國MPBIO公司；鼠抗PPARγ和NF-κB p65單克隆抗體，均購自美國Santa Cruz公司；免疫組化試劑及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3分組與造模20只小鼠隨機(jī)分為模型組和對照組，各10只，清潔級試驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)。模型組小鼠自由飲用5%DSS溶液(DSS溶于三蒸水中配制而成)，連續(xù)7天，對照組小鼠自由飲用生理鹽水7天。自造模第1天起，每日觀察小鼠的活動、體質(zhì)量變化及大便情況。以小鼠出現(xiàn)腹瀉、大便稀、隱血陽性或肉眼血便等癥狀為造模成功。

1.4結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察造模7天后，處死所有小鼠，取同水平段結(jié)腸組織，肉眼觀察其形態(tài)變化。病變部位留取一1.0×1.0×0.2cm標(biāo)本，多聚甲醛固定24小時(shí)后，石蠟包埋，連續(xù)切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化，由2名專業(yè)病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲判定，并進(jìn)行疾病活動指數(shù)(DAI)評分及病理組織學(xué)分級。DAI評分采用Sutherland標(biāo)準(zhǔn)，包括腹瀉頻率、直腸出血、黏膜表現(xiàn)和醫(yī)師評估病情4個(gè)方面，每項(xiàng)得分為0～3分[6]。病理組織學(xué)分級：據(jù)黏膜固有層炎細(xì)胞浸潤及隱窩炎癥情況，分為Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級[7]。

1.5PPARγ和NF-κB p65表達(dá)測定采用免疫組化法檢測PPARγ和NF-κB p65表達(dá)水平，鏡下觀察染色情況。PPARγ和NF-κB p65均以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出血棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，任意取5個(gè)高倍視野，以圖像分析系統(tǒng)測定表達(dá)水平。

2.結(jié)果

2.1兩組小鼠一般情況模型組在造模第2天有3只小鼠毛發(fā)無光澤，進(jìn)食量和體質(zhì)量下降；第3天，4只小鼠出現(xiàn)稀便，大便隱血陽性，隨后各小鼠均出現(xiàn)不同程度癥狀；至造模第7天，均出現(xiàn)明顯毛發(fā)脫落、精神萎靡、腹瀉、便血癥狀等，表明造模成功。對照組小鼠體質(zhì)量、飲食、大便、毛發(fā)及活動等基本正常，無死亡。

2.2兩組腸黏膜形態(tài)學(xué)及DAI評分比較模型組小鼠腸黏膜可見多發(fā)性潰瘍，大小、深淺不一，腺體結(jié)構(gòu)不清，排列紊亂，大量炎細(xì)胞(中性粒細(xì)胞為主)浸潤，黏膜下水腫，有淋巴濾泡。對照組小鼠黏膜完整、光滑、腺體清晰，無炎細(xì)胞浸潤及潰瘍。模型組小鼠DAI評分為8.42±1.13分，對照組DAI評分為0.47±0.23分，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3兩組小鼠PPARγ和NF-κB p65表達(dá)及其與病理分級的關(guān)系PPARγ主要表達(dá)于上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中，對照組可見大量陽性細(xì)胞，模型組陽性細(xì)胞較少；NF-κB在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核均有表達(dá)，細(xì)胞核更為顯著，對照組NF-κB陽性細(xì)胞較少，模型組N可見大量NF-κB陽性細(xì)胞。根據(jù)病理分級標(biāo)準(zhǔn)，模型組小鼠Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級分別為2只、3只、5只。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，病理分級越嚴(yán)重，PPARγ表達(dá)水平越低，NF-κB表達(dá)水平越高，兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1　不同病理分級小鼠PPARγ和NF-κB p65表達(dá)

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與Ⅲ級比較，#P<0.05，##P<0.01；與Ⅱ級比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3.討論

UC的發(fā)病機(jī)制目前尚無定論，目前認(rèn)為免疫反應(yīng)異?？赡苁瞧渲匾h(huán)節(jié)，多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子相互作用，形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)結(jié)腸黏膜發(fā)生炎癥損傷。PPARγ具有抑制中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和細(xì)胞因子聚集的作用，其表達(dá)受損會促進(jìn)組織炎癥損傷。結(jié)腸上皮是PPARγ的主要表達(dá)組織，其表達(dá)量僅次于脂肪組織?？孪?quán)等[7]研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ在UC模型大鼠結(jié)腸上皮中的陽性表達(dá)率為35%，而在正常大鼠中陽性表達(dá)率達(dá)80%，提示UC模型大鼠結(jié)腸組織中PPARγ表達(dá)明顯受損。NF-κB是一種重要的炎癥調(diào)控因子，試驗(yàn)研究[8，9]表明，NF-κB在模型組小鼠腸黏膜中的表達(dá)水平顯著高于正常小鼠，可作為治療UC的靶點(diǎn)。臨床研究也表明，在UC活動期患者的腸黏膜組織中，其表達(dá)水平顯著升高，且與病理分級呈正相關(guān)[10]。此外，有研究表明，PPARγ與NF-κB p65之間可能存在信號通路，PPARγ配體在激活PPARγ的同時(shí)抑制NF-κB的活性，從而抑制細(xì)胞因子的表達(dá)，緩解炎癥損傷[11]。

本研究結(jié)果表明，PPARγ主要表達(dá)于對照組上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中，模型組陽性細(xì)胞較少，NF-κB主要表達(dá)于模型組細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中，對照組陽性細(xì)胞較少，且病理分級越嚴(yán)重，PPARγ表達(dá)水平越低，NF-κB表達(dá)水平越高，與上述報(bào)道基本一致，提示PPARγ和NFkB P65可能參與UC小鼠炎癥的發(fā)生發(fā)展，聯(lián)合檢測這2項(xiàng)指標(biāo)有助于判定UC的病情，并為治療提供可能的靶點(diǎn)。

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作者單位：西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科710004

基金項(xiàng)目：中國高校醫(yī)學(xué)期刊臨床專項(xiàng)資金(11521594)

doi:10.3969/j.issn.1672-4860.2015.04.016

收稿日期：2015-5-10

Expression and significance of PPARγ and NFkB p65 in intestinal mucosal tissues of mice with ulcerative colitis(YINJian,DONGLei.Departmentofgastroenterology,ThesecondaffiliatedhospitalofXi’anJiaotonguniversity,Xi’an710004,China.)

【Abstract】ObjectivesTo explore the expression and significance of peroxisome proliferators activated receptor (PPARγ) and nuclear factor kappa-kB p 65 (NFkB p65) in the intestinal mucosal tissues of mice with ulcerative colitis (UC). MethodsA total of 20 healthy mice were randomly divided into model group and control group, 10 for each group.Model group was given 5% dextra sulfate sodium (DSS) freely for continuously 7days, whereas control group with normal saline for 7days.After model establishment, the mice were sacrificed to obtain the colonic tissues of the same segment.Immunohistochemistry was used to observe the morphological changes of mucous membrane of mice in both groups, evaluate disease activity index (DAI) score and histopathological grades, and detect the expression of PPARγ and NF-κB p65. ResultsDAI scores were 8.42±1.13 points and 0.47±0.23 points in model group and control group respectively, and there was significant difference (P<0.01).PPARγ and NF-κB mainly expressed in the nucleus of epithelial cells.Control group showed abundant PPARγ positive cells but less NF-κB positive cells, whereas model group showed less PPARγ positive cells but abundant NF-κB positive cells.In model group, the severer the pathological grade, the lower the PPARγ expression level and the higher the NF-κB expression levels, which had significant differences when compared with control group (P<0.01).ConclusionsPPARγ and NFkB P65 may participate in the development and progression of the inflammation in UC mice, and their combined detection can help diagnose the disease severity.

【Key words】peroxisome proliferators activated receptor, nuclear factor kappa-kB, ulcerative colitis, immunohistochemistry

※為通訊作者