·論著·

氧化介孔碳球納米粒作為紫杉醇載體的研究

王歡1，佘嵐2，王琳召1，馬志強(qiáng)2，張欣榮2，楊峰1,2(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350108；2. 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院無機(jī)化學(xué)教研室，上海 200433)

[摘要]目的制備氧化介孔碳球納米粒(oMCN)，考察其理化性質(zhì)以及作為抗腫瘤藥物紫杉醇遞送載體的研究。方法采用低濃度水熱法合成介孔碳球納米粒，觀察其形貌特征，測定其介孔性質(zhì)參數(shù)、粒徑、Zeta電位、載藥量大小，利用透析法研究體外釋藥行為，用CCK-8法考察體外抗腫瘤活性。結(jié)果oMCN的比表面積為704.63 m2/g、孔容積為0.57 cm3/g、孔徑分布約為3.23 nm、平均粒徑為140 nm、Zeta電位為 -36 mV、載藥量高達(dá)45.6%，72 h體外累積釋藥量為57.6%，具有良好的藥物負(fù)載與緩釋性能，對小鼠肺癌LLC細(xì)胞具有顯著的抑制作用。結(jié)論oMCN作為抗腫瘤藥物紫杉醇的載體具有較好的應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞]介孔碳；納米粒；氧化修飾；腫瘤；載藥系統(tǒng)

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)

[作者簡介]王歡，碩士研究生，研究方向：藥物緩控釋給藥系統(tǒng). E-mail: wang568855641@163.com

[通訊作者]楊峰，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物緩控釋給藥系統(tǒng). E-mail: yangfeng1008@126.com

[中圖分類號]R94[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.005

[收稿日期]2014-09-18[修回日期]2015-01-10

Oxidized meosporous carbon nanospheres as carriers for paclitaxel

WANG Huan1,SHE Lan2,WANG Linzhao1,MA Zhiqiang2, ZHANG Xinrong2,YANG Feng1,2(1.School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108,China; 2.Department of Inorganic Chemistry, School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

Abstract[]ObjectiveTo prepare oxidized mesoporous carbon nanospheres and investigate potential application as drug delivery carriers for paclitaxel.MethodsPhysicochemical properties such as morphology, diameter, pore diameter and pore volume were characterized. Drug-loading capacity was measured and drug release behavior in vitro was investigated by dialysis method. In vitro antitumour effect was evaluated by CCK-8 methods.ResultsThe synthesized oxidized mesoporous carbon nanospheres had an average diameter of 140 nm, Zeta potential of -36 mV, high specific surface area of 704.63 m2/g,high drug-loading capacity of 45.6%.ConclusionOxidized mesoporous carbon nanospheres have promising application in anti-cancer drug delivery system.

[Key words]mesoporous carbon; nanoparticles; surface modification；tumour; drug delivery system

介孔材料是指具有孔徑在2～50 nm之間有序孔道結(jié)構(gòu)的材料，它們具有較大的比表面積、孔容積和有序開放的孔道結(jié)構(gòu)，在吸附、催化、能量儲存等領(lǐng)域有較為廣泛的應(yīng)用[1-3]。Vallet等[4]2001年首次報(bào)道了以介孔分子篩作為藥物的緩釋載體，近年來基于介孔碳材料在藥物傳遞系統(tǒng)的應(yīng)用得到了研究者們的密切關(guān)注[5-8]。本研究中，筆者合成納米粒徑的介孔碳球，對其表面氧化修飾改善碳材料固有的疏水性質(zhì)，制得氧化介孔碳球納米粒(oMCN)，以抗腫瘤藥物紫杉醇(paclitaxel，PTX)為模型藥物，考察了oMCN作為紫杉醇藥物載體的可能應(yīng)用前景。

1材料與方法

1.1儀器與試劑電阻爐(SK2-1-10，上海意豐電爐有限公司)，紫外分光光度儀(Lambda25，DerkinElmer公司)，納米粒度-Zeta電位測定儀(ZetasizerNano ZS，英國馬爾文公司)，熒光顯微鏡(Olympus公司)，臺式超速離心機(jī)(Centifuge5424，Hitachi公司)，恒溫振蕩培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司)。紫杉醇原料藥(PTX，江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司), 異硫氰酸熒光素(FITC，大連美侖生物有限公司)，LLC細(xì)胞株(第二軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，其他為實(shí)驗(yàn)室常用儀器與試劑。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1介孔碳球納米粒的制備及其表面修飾根據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道方法合成介孔碳球納米粒(MCN)，步驟如下：0.6 g苯酚固體先于45 ℃水浴中融化，隨即加入15 ml、0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，攪拌10 min后再加入2.1 ml的甲醛溶液(37%)，升溫至70 ℃繼續(xù)攪拌30 min，即制備了低分子量的酚醛樹脂。另稱取0.96 g的三嵌段共聚物F127溶于15 ml的去離子水中，加入到上述混合液中，66 ℃下以(340±20)r/min速率攪拌2 h后，加入50 ml的去離子水稀釋，繼續(xù)攪拌約16 h直至瓶底出現(xiàn)沉積物。整個反應(yīng)過程中，溶液顏色從無色到粉紅、最后到深紅色。取17.7 ml的反應(yīng)液再加45 ml水稀釋，密封于水熱斧中，在130 ℃下處理24 h。以10 000 r/min離心10 min收集產(chǎn)物，室溫干燥。最后干燥粉末在N2氛圍中700 ℃條件下焙燒3 h，即得MCN。

精密稱取100 mg的MCN，超聲分散于50 ml的雙氧水中，持續(xù)超聲處理4 h。為防止水溫過高，每0.5 h換一次超聲池里的水。100 ℃干燥收集固體粉末，即得oMCN。

1.2.2材料的表征利用FTIR分析產(chǎn)物的特征官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，記錄500～4 000 cm-1范圍內(nèi)的掃描圖譜。利用小角X射線散射(SAXS)考察樣品介觀結(jié)構(gòu)特征，管壓40 kV，管流35 mV，記錄時(shí)間30 min。d值通過公式(d= 2π/q)計(jì)算。采用透射電鏡考察納米粒的形貌特征。利用比表面積分析儀測定材料的結(jié)構(gòu)參數(shù)，采用BET和BJH方法計(jì)算比表面積和孔徑分布，相對壓力P/P0=0.99時(shí)的吸附量計(jì)算孔容。采用激光粒度儀考察材料粒徑大小、分布及Zeta電位。

1.2.3PTX的負(fù)載及載藥量的計(jì)算采用溶劑浸漬平衡與溶劑揮發(fā)過程裝載抗腫瘤藥物PTX。步驟如下：將oMCN粉末超聲分散于10 ml濃度為2 mg/ml的紫杉醇-乙醇溶液中，超聲處理30 min后，繼續(xù)攪拌24 h。之后在室溫中，減壓狀態(tài)下緩慢旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2 h以去除有機(jī)溶劑。再用乙醇與水交替洗滌固體3次，離心收集沉淀，40 ℃下真空干燥，即得裝載有PTX的oMCN，命名為oMCN@PTX。

對于載藥量的計(jì)算，首先精密稱取5 mg的oMCN@PTX固體粉末，超聲分散于200 ml的甲醇溶液中，攪拌12 h使載體中的藥物充分釋放溶解。溶液高速離心后，過厚度0.22 μm濾膜。利用紫外可見分光光度法測定濾液在227 nm處的吸光度(A)值。代入PTX標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算oMCN@PTX分散體系中PTX的含量，并按以下公式計(jì)算載藥率與包封率：

載藥率=(載藥納米粒中的藥物含量/載藥納米粒的總量)×100%

包封率=(載藥納米粒中的藥物含量/投藥量)×100%

1.2.4PTX的體外釋放研究精密稱取oMCN@PTX粉末，分散于2 ml的DMSO溶液中，分散液密封于透析管中(截留分子量為10 000 g/mol)，投入30 ml pH值7.4的磷酸緩沖液中，在37 ℃的恒溫箱中以100 r/min的速率振蕩，定時(shí)取樣2 ml，并補(bǔ)充新鮮的等溫、等體積磷酸緩沖液。所有樣品在4 ℃下15 000 r/min離心30 min，紫外分光光度法測定227 nm處的A值。計(jì)算PTX在各個時(shí)間點(diǎn)累積釋藥率Q，計(jì)算公式如下：

V0：釋放介質(zhì)的總體積；Ct=各個時(shí)間點(diǎn)釋放介質(zhì)中的PTX濃度(μg/ml)；V：每次取樣的體積；W：投入的oMCN@PTX的總質(zhì)量；X：oMCN@PTX的載藥量(%)。

1.2.5細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)將對數(shù)期生長的LLC細(xì)胞調(diào)整濃度為5×105個/ml，鋪于6孔板中，用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基在37 ℃及5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后棄去上清液，加入濃度約為50 μg/ml的oMCN@FITC培養(yǎng)基溶液與細(xì)胞共孵育2 h。用4%的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞20 min后，再用含有20 μl的DAPI的200 μl的PBS溶液染核20 min，PBS洗盡殘余染料后用熒光顯微鏡觀察碳球納米粒被LLC細(xì)胞攝取情況。

1.2.6細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)用CCK-8法評價(jià)oMCN的生物安全性及oMCN@PTX的細(xì)胞毒性。調(diào)整LLC細(xì)胞濃度為5×104個/ml，以每孔100 μl培養(yǎng)在96孔板中，24 h后分別加入不同濃度的oMCN、oMCN@PTX和PTX(PTX先用DMSO溶解再用含血清培養(yǎng)基稀釋，DMSO含量<0.1%)，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)立空白溶劑組和陰性對照組。24 h后加入10%的100 μl的CCK-8培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)在37 ℃下及5%的CO2中培養(yǎng)2 h，顏色變化后用酶標(biāo)儀測量在450 nm處的A值，計(jì)算細(xì)胞相對存活率大小，公式如下：

細(xì)胞相對存活率(%)=

2結(jié)果

2.1MCN的制備及表征按照文獻(xiàn)[9]方法，筆者先以三嵌段共聚物F127為模板，酚醛樹脂為碳源，利用低濃度水熱的方法合成了MCN材料。然后，為了改善碳材料固有的疏水特性，又以雙氧水為氧化劑用濕熱氧化法對碳球表面進(jìn)行氧化處理，以期引入親水性的官能團(tuán)，提高納米粒的親水性和分散性。紅外光譜(FTIR)圖(圖1)清晰地表明所合成的oMCN除了具有類似MCN典型的芳香烴結(jié)構(gòu)外，在1 722 cm-1處出現(xiàn)了羰基伸縮振動峰，在1 190 cm-1處出現(xiàn)了碳氧單鍵伸縮振動峰，表明我們成功地在納米粒表面引入了含氧官能團(tuán)。

圖1　MCN與oMCN的紅外光譜(FTIR)圖譜

利用透射電鏡(TEM)對材料進(jìn)行形貌的表征。結(jié)果如圖2示，MCN與oMCN為規(guī)則的球型，大小均一，兩者粒徑都在140 nm左右。氧化前后納米粒表面介孔孔道都排列有序，說明利用雙氧水濕熱氧化并不會破壞納米粒原有的介觀結(jié)構(gòu)。

圖2　材料的透射電鏡(TEM)照片 A.×20 000, MCN;B.×200 000, MCN;C.×40 000, oMCN;D.×80 000, oMCN

圖3　材料的理化性質(zhì)表征結(jié)果圖 A. MCN與oMCN的小角X射線散射圖譜;B.oMCN的N 2吸附脫附等溫線與孔徑分布圖; C. MCN與oMCN的粒徑分布圖;D.MCN與oMCN的Zeta電位分布圖

2.2oMCN對PTX的負(fù)載及釋放根據(jù)不同濃度的PTX甲醇溶液在227 nm處的A值，筆者首先作了PTX溶液濃度 (C) 與吸光度值 (A) 的標(biāo)準(zhǔn)曲線 (圖4A)， 建立直線回歸方程，為A=0.063 38+0.034 37C,該曲線在濃度1.25～40 μg/ml范圍內(nèi)具有較高的相關(guān)性(r=0.999 82)及較小的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s=0.015 03)。

利用oMCN對PTX進(jìn)行負(fù)載，將PTX溶解于乙醇，配制成較高濃度的溶液，再與oMCN充分?jǐn)嚢杌旌?，使PTX充分吸附于oMCN的介孔孔道里。待乙醇揮發(fā)干凈后，用水與乙醇重復(fù)洗滌以除去未被吸附或者吸附于oMCN淺表面的PTX分子，即得到載有藥物的納米粒oMCN@PTX。將oMCN@PTX分散在過量的甲醇中，使PTX充分釋放并溶解，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程測得溶出液中PTX的含量，計(jì)算載藥率為45.56%，結(jié)果比一般的納米載體要高，這是因?yàn)镻TX是芳香族化合物，而oMCN為具有缺陷石墨烯結(jié)構(gòu)的基面，藥物和載體可以通過π-π堆積力和疏水作用緊密結(jié)合[10,11]。在體外釋放的研究中，我們采用疏水環(huán)境作為oMCN@PTX的溶出介質(zhì)，因?yàn)镻TX為難溶性藥物，在水性環(huán)境中大多保留在孔道內(nèi)，而當(dāng)載體被細(xì)胞吞噬達(dá)到細(xì)胞的疏水環(huán)境后，藥物就能緩慢釋放出來[12]。 如圖4B所示，游離的藥物在12 h時(shí)幾乎釋放完全，而oMCN@PTX顯示出良好的緩釋性能，前12 h以內(nèi)約有29.2%的藥物迅速釋放，之后緩慢釋藥，直至48 h時(shí)到達(dá)平臺期，可以使血藥濃度在治療窗內(nèi)保持平緩，72 h總釋放量為57.6%。以上結(jié)果表明，oMCN十分適合作為疏水性藥物的載釋容器。

2.3細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)為了考察LLC細(xì)胞對oMCN的攝取，筆者選取小鼠肺癌細(xì)胞LLC為研究對象。首先，以綠色熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記oMCN，制備了oMCN@FITC，利用熒光顯微鏡觀察LLC對納米粒的攝取。如圖5所示，黑色的粒子周圍具有明顯的綠色熒光，且環(huán)繞著細(xì)胞核分布在細(xì)胞液中，為oMCN@FITC釋放的FITC所致。結(jié)果說明oMCN可以負(fù)載客體分子透過細(xì)胞膜，并且在細(xì)胞液中釋放客體分子。

圖4　PTX溶液紫外吸收曲線，吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線及藥物的體外釋放曲線 A.不同濃度的PTX甲醇溶液的紫外吸收曲線與吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.游離PTX與oMCN@PTX體外釋放曲線

圖5　LLC與oMCN@FITC在37 ℃下共孵育2 h后的熒光顯微鏡圖像(×200) A.可見光下直接觀察內(nèi)吞情況；B.DAPI染核后的藍(lán)色熒光圖像；C.oMCN@FITC的綠色熒光圖像；D.A、B、C圖的融合圖像

2.4細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法評價(jià)載藥體系對LLC的細(xì)胞毒性，如圖6A所示，單獨(dú)藥物與oMCN@PTX對LLC細(xì)胞的毒性都有劑量依賴性，隨著藥物濃度增加，對細(xì)胞的殺傷力隨之增強(qiáng)。特別在6.25～50 μg/ml濃度范圍內(nèi)，oMCN@PTX的殺傷力明顯強(qiáng)于單純藥物(P=4.1×10-4<0.05)，可能是載體oMCN能更有效地負(fù)載PTX進(jìn)入細(xì)胞，并釋放藥物。通過計(jì)算，單純藥物與oMCN@PTX的IC50值分別為7.065與4.936 μg/ml。如圖6B所示，考察了空白載體對LLC的毒性，發(fā)現(xiàn)即使oMCN的濃度達(dá)到50 μg/ml，與LLC細(xì)胞作用24 h后，細(xì)胞存活率仍達(dá)到80%，說明oMCN本身對LLC的毒性小，而oMCN@PTX對細(xì)胞的殺傷力來自其釋放的藥物分子。

圖6　載藥系統(tǒng)與空白載體對LLC細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果圖 A.不同濃度的單純藥物與oMCN@PTX與LLC細(xì)胞作用24 h后的細(xì)胞相對存活率； B.不同濃度的空白載體oMCN與LLC細(xì)胞作用24 h和48 h的細(xì)胞相對存活率

3討論

本研究成功合成了MCN，并用雙氧水作為溫和氧化劑在納米粒表面引入了含氧官能團(tuán)，顯著改善了納米粒的分散性，提高了親水性。筆者制備的oMCN粒徑約為140 nm，Zeta電位為-36 mV。根據(jù)腫瘤組織特異的EPR效應(yīng)，合適的粒徑大小賦予了納米粒被動靶向能力。oMCN比表面積為704.63 m2/g,孔容積為0.57 cm3/g，孔徑為3.23 nm。此外，oMCN通過疏水作用以及π-π堆積力可以負(fù)載大量的PTX分子，載藥量達(dá)45.56%，對藥物具有緩釋效果，十分適合作為難溶性藥物的載體。體外實(shí)驗(yàn)證明，oMCN可以有效地負(fù)載客體分子透過細(xì)胞膜，在細(xì)胞質(zhì)中釋放藥物，該載藥體系對LLC細(xì)胞具有良好的殺傷力，殺傷效果高于單獨(dú)藥物，而載體本身顯示著良好的安全性。

本研究仍存在一些問題亟待解決，譬如載藥體系的體內(nèi)抗腫瘤效果，載體的體內(nèi)代謝命運(yùn)等問題。本實(shí)驗(yàn)為MCN在抗腫瘤藥物傳遞系統(tǒng)的研究提供一定的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)，相信該載藥體系在有效地增溶難溶性藥物，提高抗腫瘤藥物的生物利用度，發(fā)揮治療效果中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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[本文編輯]陳靜