（湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧443100）

二甲雙胍屬雙胍類胰島素增敏劑，其藥用形式為鹽酸二甲雙胍（metformin hydrochloride），化學(xué)名為1，1－二甲基雙胍鹽酸鹽（N，N－dimethylimidodicarbonimidic diamide hydrochloride），易溶于水［1］。臨床上主要用于僅由飲食控制無效的輕、中度Ⅱ型糖尿病，特別有利于治療肥胖或者超重的Ⅱ型糖尿病，亦可用于非肥胖型糖尿病的初步治療［2］。

血清白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，且結(jié)構(gòu)簡單，可與許多內(nèi)源性或者外源性化合物發(fā)生相互作用，并對這些物質(zhì)在生物體內(nèi)的存儲(chǔ)與轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮重要作用［3－4］。牛血清白蛋白（BSA）與人血清白蛋白（HSA）的結(jié)構(gòu)高度相似，二者的氨基酸序列也高度相似，而且BSA 的價(jià)格便宜，因此人們常常研究藥物與BSA 的結(jié)合情況，作為與HSA 結(jié)合情況的參考［5－6］。

有關(guān)雙胍類胰島素增敏劑與BSA 的作用機(jī)理的研究少有報(bào)道，研究鹽酸二甲雙胍與BSA 的相互作用對于探索雙胍類胰島素增敏劑的臨床用藥以及藥物劑型的改良具有重要的指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

鹽酸二甲雙胍對照品（含量100%，以C4H11N5·HCl計(jì)），中國食品藥品檢定研究院；BSA，中國科學(xué)院化學(xué)研究所；三羥甲基氨基甲烷（Tris），上海伯奧生物科技有限公司；氯化鈉、硫酸銅、乙酸鎂，分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

PHS－3C 型酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HH－4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；RF－5301PC 型熒光分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 鹽酸二甲雙胍對BSA 的熒光猝滅作用

分別在29℃、33℃、37℃下，稱取適量BSA 溶于pH＝7.4的Tris－HCl緩沖溶液（含適量NaCl），配制成1×10－5mol·L－1的BSA 溶液。在1cm 比色皿中加入2 mL 上述BSA 溶液，每次加入濃度為0.122 mol·L－1的鹽酸二甲雙胍水溶液30μL，保溫5min，再以λex為282nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為10 nm、5nm，在300～500nm 范圍內(nèi)掃描熒光光譜，得鹽酸二甲雙胍對BSA 的熒光猝滅光譜。

1.2.2 鹽酸二甲雙胍對BSA 熒光猝滅類型的確定

鹽酸二甲雙胍對BSA 的熒光猝滅類型先按動(dòng)態(tài)猝滅的Stern－Volmer方程處理［7］，對于不同的溫度，分別以F0／F－1對鹽酸二甲雙胍溶液的濃度c作圖。求得563K、567K、571K 時(shí)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)（KSV）、動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)（Kq）。

1.2.3 鹽酸二甲雙胍與BSA 相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和作用力類型分析

反應(yīng)的焓變（ΔH）、自由能（ΔG）和熵變（ΔS）三者之間的關(guān)系式為：

式中：K類似于相應(yīng)溫度下的Stern－Volmer方程中的KSV。

以lnK對1／T作圖得到直線，由直線截距和斜率可求出ΔS、ΔH，同時(shí)根據(jù)式（2）可求算ΔG。

1.2.4 鹽酸二甲雙胍與BSA 相互作用的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算

生物大分子與藥物小分子相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和猝滅劑濃度c之間滿足方程：

以lg（F0／F－1）對lgc進(jìn)行線性回歸，由直線截距和斜率可求出鹽酸二甲雙胍與BSA 相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。

1.2.5 金屬離子對鹽酸二甲雙胍與BSA 相互作用的影響

同1.2.1方法測定比色皿中分別加入濃度為5×10－3mol·L－1的乙酸鎂、硫酸銅溶液4μL 時(shí)鹽酸二甲雙胍對BSA 的熒光猝滅光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽酸二甲雙胍對BSA的熒光猝滅作用

不同濃度鹽酸二甲雙胍對BSA 的熒光猝滅光譜如圖1所示。

由圖1可知，隨著鹽酸二甲雙胍濃度的增加，BSA的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度逐漸減弱，峰位置和峰形基本保持恒定。表明鹽酸二甲雙胍能猝滅BSA 的內(nèi)源性熒光，二者之間有相互作用。

2.2 鹽酸二甲雙胍對BSA的熒光猝滅類型

不同溫度下，鹽酸二甲雙胍對BSA 的（F0／F－1）～c曲線的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、KSV及Kq如表1所示。

圖1 不同濃度鹽酸二甲雙胍對BSA的熒光猝滅光譜Fig.1 Fluorescence quenching spectra of BSA with different concentrations of metformin hydrochloride

表1 鹽酸二甲雙胍對BSA的（F0／F－1）～c曲線的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、KSV及KqTab.1 Regression equations，correlation coefficients，KSVand Kqof（F0／F－1）～c curve for BSA with metformin hydrochloride

由表1 可知，隨著溫度的升高，鹽酸二甲雙胍對BSA 的猝滅常數(shù)KSV升高，表明熒光猝滅的類型為分子擴(kuò)散和碰撞所引起的動(dòng)態(tài)猝滅。通常情況下認(rèn)為，各種熒光猝滅劑對生物大分子的動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)的最大值約為2.0×1010L·mol－1·s－1。本實(shí)驗(yàn)563 K、567K、571K 時(shí)鹽酸二甲雙胍對BSA 的動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq分別為7.212×108L·mol－1·s－1、7.926×108L·mol－1·s－1、9.227×108L·mol－1·s－1，均小于2.0×1010L·mol－1·s－1，進(jìn)一步證實(shí)了鹽酸二甲雙胍與BSA 的相互作用具有顯著的動(dòng)態(tài)猝滅特征。

2.3 相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和作用力類型

不同溫度下，鹽酸二甲雙胍對BSA 的lnK～1／T曲線如圖2所示。鹽酸二甲雙胍與BSA 相互作用的熱力學(xué)參數(shù)見表2。

由表2可知：ΔG為負(fù)值，表明鹽酸二甲雙胍與BSA 相互作用的過程是自發(fā)進(jìn)行的；ΔH＞0且ΔS＞0，根據(jù)Ross的生物大分子與小分子作用力類型理論［8］，鹽酸二甲雙胍與BSA 之間的作用力主要表現(xiàn)為疏水作用力。

圖2 563K、567K、571K 下鹽酸二甲雙胍對BSA的lnK～1／T 曲線Fig.2 The lnK～1／Tcurves of BSA with metformin hydrochloride at 563K，567K，571K

表2 563K、567K、571K 下鹽酸二甲雙胍與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Tab.2 Thermodynamic parameters of interaction between metformin hydrochloride and BSA at 563K，567K，571K

2.4 結(jié)合常數(shù)Ka 和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

不同溫度下，鹽酸二甲雙胍對BSA 的lg（F0／F－1）～lgc曲線的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、lgKa、Ka和n見表3。

表3 563K、567K、571K 鹽酸二甲雙胍對BSA的lg（F0／F－1）～lgc曲線的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、lgKa、Ka 和nTab.3 Regression equations，correlation coefficients，lgKa，Kaand nof BSA with metformin hydrochloride for lg（F0／F－1）～lgc curve at 563K，567K，571K

由表3可知：鹽酸二甲雙胍與BSA 的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n的平均值為0.9206，表明兩者之間形成了一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；隨著溫度的升高，結(jié)合常數(shù)Ka逐漸增大，這可能是由于溫度的升高使藥物小分子和蛋白質(zhì)分子之間的分子擴(kuò)散和碰撞增強(qiáng)，從而導(dǎo)致了結(jié)合常數(shù)的增大。

2.5 金屬離子的影響

根據(jù)Stern－Volmer方程測得：571 K 時(shí)，有、無Cu2＋存在的情況下，KSV（Cu2＋）／KSV＝0.602、Ka（Cu2＋）／Ka＝0.165；有、無Mg2＋存在的情況下，KSV（Mg2＋）／KSV＝0.737、Ka（Mg2＋）／Ka＝0.441。表明Cu2＋、Mg2＋的存在降低了藥物和BSA 的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)KSV和結(jié)合常數(shù)Ka。同時(shí)，在Cu2＋、Mg2＋存在下的ΔG分別為－4.42kJ·mol－1、－4.94kJ·mol－1，較鹽酸二甲雙胍與BSA 相互作用時(shí)的ΔG（－5.73kJ·mol－1）大，進(jìn)一步說明了Cu2＋、Mg2＋的存在使鹽酸二甲雙胍與BSA 的動(dòng)態(tài)猝滅作用更難發(fā)生。原因可能是金屬離子的存在導(dǎo)致藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合的緊鄰區(qū)域構(gòu)型發(fā)生改變，從而削弱了藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合，使藥物對BSA 的熒光猝滅作用減弱［9］。

3 結(jié)論

采用熒光光譜法研究鹽酸二甲雙胍與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用以及常見金屬離子對鹽酸二甲雙胍和BSA 相互作用的影響。結(jié)果表明：鹽酸二甲雙胍對BSA 的熒光猝滅為動(dòng)態(tài)猝滅，兩者之間的作用力類型為疏水作用力；隨著溫度的升高，鹽酸二甲雙胍與BSA 的結(jié)合常數(shù)增大，表明溫度的升高有利于鹽酸二甲雙胍對BSA 的動(dòng)態(tài)猝滅作用；在Cu2＋、Mg2＋存在下，鹽酸二甲雙胍與BSA 的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)KSV和結(jié)合常數(shù)Ka均降低，表明Cu2＋、Mg2＋的存在不利于鹽酸二甲雙胍與BSA 的結(jié)合，削弱了二者的相互作用。

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