（武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430074）

基因治療作為一種新的治療方法在治療威脅人類健康的重大疾病方面具有很好前景。近年來，科研人員發(fā)展了許多基因傳遞載體用于保護(hù)質(zhì)粒DNA，防止其在體內(nèi)降解失活、提高其被細(xì)胞攝取比例［1］。

磷酸鈣是一類生物相容性好的生物材料，人體的牙齒和骨骼都含有磷酸鈣。1973 年，Graham 等［2］發(fā)明了標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法，該法十分簡(jiǎn)單，只有兩步：首先將氯化鈣溶液與DNA 溶液混合，再與磷酸鹽混合即得到磷酸鈣與DNA（Ca－P／DNA）的共沉淀。DNA 能很好地吸附在磷酸鈣上可能是因?yàn)榱姿徕}與核酸上的磷酸根有較強(qiáng)的親和力。

Ca－P／DNA 共沉淀技術(shù)是最常用的復(fù)合DNA 技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、毒性小、體外轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)，但是沉淀?xiàng)l件（如濃度、溫度、pH 值、混合速率、沉淀時(shí)間等）難以控制，從而影響了轉(zhuǎn)染效率的穩(wěn)定性。此外，獲得較高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)還會(huì)帶來較高的細(xì)胞毒性［3］。因此，Ca－P／DNA 共沉淀的基因轉(zhuǎn)染效果重現(xiàn)性不好。但是基于磷酸鈣很好的生物相容性和生物降解性，Maitra［4］甚至認(rèn)為它是“第二代非病毒基因載體”。許多研究者對(duì)沉淀?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，從而提高了轉(zhuǎn)染效率。Kakizawa等［5］用嵌段共聚物控制磷酸鈣納米粒子的粒徑，提高了轉(zhuǎn)染效率，并且用其成功傳遞siRNA；Olton 等［6］制備了單分散的磷酸鈣納米粒子（Ca／P 值高達(dá)110∶1～300∶1，粒徑25～50nm），優(yōu)化了沉淀?xiàng)l件，取得很高的轉(zhuǎn)染效率。

由于Ca－P／DNA 共沉淀的轉(zhuǎn)染效率與Ca／P 值密切相關(guān)，通常Ca／P值較小時(shí)，生成的沉淀納米粒子多而轉(zhuǎn)染效率高，但是細(xì)胞毒性也相對(duì)較大；Ca／P 值較大時(shí)，生成的沉淀納米粒子少而轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞毒性小。因此，作者在此用少量商業(yè)化的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000復(fù)合未形成Ca－P／DNA 共沉淀的游離DNA，協(xié)同高Ca／P值的Ca－P／DNA 共沉淀以提高基因轉(zhuǎn)染效率，并保持其較低的細(xì)胞毒性，以期獲得一種低毒高效的基因轉(zhuǎn)染方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

人胚胎腎細(xì)胞（293T）和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（NIH3T3）均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢），用含10% 胎牛血清、2mg·mL－1NaHCO3和100U·mL－1雙抗的DMEM（Gibco）培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3－Luc 購自Promega，在Escherichiacoli中擴(kuò)增并用E.Z.N.A.fastfilter endo－free plasmid maxi kit（Omega）提取純化，溶解在純水中，于－20 ℃保存。

脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 購自Invitrogen。

二甲基亞砜（DMSO）、氯化鈣、十水合磷酸三鈉等均為分析純，未經(jīng)提純直接使用。

1.2 Ca－P／DNA 共沉淀的制備

首先，將10μg 質(zhì)粒DNA 與25μL 2mol·L－1CaCl2混合，再用去離子水稀釋到204μL，然后將得到的溶液迅速加入到204μL 濃度分別為4.96mmol·L－1、1.65mmol·L－1、0.5 mmol·L－1的Na3PO4溶液中，混合均勻，即得到Ca／P 值分別為50、150、500的Ca－P／DNA 共沉淀，分別編號(hào)為A、B、C。

1.3 Lipofectamine 2000／DNA 復(fù)合物的制備

分別將0.1μL、0.2μL、0.4μL、1.0μL Lipofectamine 2000 和1μg 質(zhì)粒DNA 用蒸餾水稀釋到50μL，室溫放置5min 后，將Lipofectamine 2000 水溶液加入質(zhì)粒DNA 溶液中混合均勻，室溫放置20 min，即得到Lipofectamine 2000 和DNA 比率（μL∶μg）分別為0.1∶1、0.2∶1、0.4∶1、1.0∶1的Lipofectamine 2000／DNA 復(fù)合物，分別編號(hào)為A′、B′、C′、D′。

1.4 脂質(zhì)體協(xié)同Ca－P／DNA 共沉淀的制備

向不同Ca／P值的Ca－P／DNA 共沉淀懸液中加入不同量的Lipofectamine 2000，混合均勻后，室溫放置20min，即得到脂質(zhì)體協(xié)同Ca－P／DNA 共沉淀，分別編號(hào)（表1）進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染研究。

表1 脂質(zhì)體協(xié)同Ca－P／DNA共沉淀Tab .1 Ca－P／DNAco－precipitations in coordination with liposome

1.5 體外轉(zhuǎn)染

將含8×104個(gè)·mL－1細(xì)胞的完全培養(yǎng)基直接種入24 孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁生長24h 后加入Lipofectamine 2000／DNA 復(fù)合物懸液，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定基因表達(dá)量。

為了檢測(cè)熒光素酶（luciferase）的表達(dá)，去除培養(yǎng)基，用0.1mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液（pH 值7.4）輕輕潤洗細(xì)胞，然后按每孔200μL 加入裂解液（Promega），充分裂解后，離心，取20μL 上清液與100μL熒光素酶底物（Promega）充分混合，用化學(xué)發(fā)光儀（Lumat LB9507，Berthold）測(cè)定熒光素酶的活性。

細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)濃度用BCA Protein Assay Reagent Kit試劑盒（Pierce）測(cè)定；用酶標(biāo)儀（Biorad 550）在570nm 處測(cè)定OD值。每個(gè)樣品做3 個(gè)平行樣，取平均值，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。

1.6 細(xì)胞存活率的計(jì)算

pGL3－Luc轉(zhuǎn)染48h后，去除培養(yǎng)基，每孔加入新鮮培養(yǎng)基1mL 和MTT 60μL（5mg·mL－1），37 ℃培養(yǎng)4h。小心吸除上清液，每孔加入0.8 mL DMSO，輕輕振搖5min 溶解由活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原MTT 得到的藍(lán)紫色甲瓚晶體，用酶標(biāo)儀于570nm 處測(cè)定溶液的OD值。以24 孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)的細(xì)胞的存活率作為對(duì)照。每個(gè)樣品做5 個(gè)平行樣，取平均值，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。

1.7 未復(fù)合DNA 的量的測(cè)定

分別制備Ca－P／DNA 共沉淀和脂質(zhì)體協(xié)同Ca－P／DNA 共沉淀后，離心，取100μL 上清液用于測(cè)定未復(fù)合DNA 的量。上清液中DNA（pGL3－Luc）的濃度用Quant－iTTMPicoGreen dsDNA Assay Kit（Molecular Probes）試劑盒測(cè)定。每個(gè)樣品做3 個(gè)平行樣，取平均值，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ca－P／DNA 共沉淀對(duì)293T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

Ca／P值為50、150、500 時(shí)，Ca－P／DNA 共沉淀對(duì)293T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率（以每毫克蛋白的相對(duì)熒光強(qiáng)度表示，值越大，轉(zhuǎn)染效率越高）見圖1。

圖1 Ca－P／DNA共沉淀和Lipofectamine 2000／DNA復(fù)合物在293T 細(xì)胞中的熒光素酶表達(dá)Fig.1 Luciferase expression in cell 293Ttransfected with Ca－P／DNAco－precipitations and Lipofectamine 2000／DNA compound

由圖1可看出，Ca／P值為50時(shí)的Ca－P／DNA 共沉淀轉(zhuǎn)染效率比Ca／P值為150和500 時(shí)高2～3 個(gè)數(shù)量級(jí)，與文獻(xiàn)［6］一致。雖然Ca／P值為50時(shí)的基因轉(zhuǎn)染效率最高，但細(xì)胞存活率只有75%（圖2），細(xì)胞毒性最大。

圖2 293T細(xì)胞在Ca－P／DNA共沉淀和Lipofectamine 2000／DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞存活率Fig.2 Cell viability of cell 293Ttransfected for 48hwith Ca－P／DNAco－precipitations and Lipofectamine 2000／DNA compound

Ca－P／DNA 共沉淀技術(shù)是DNA 在氯化鈣與磷酸鈉沉淀反應(yīng)中伴隨磷酸鈣納米粒子的生成共同沉淀在細(xì)胞表面，Strain等［7］研究表明，只有約7%的DNA能從內(nèi)涵體逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)入細(xì)胞核的DNA 更是少于4%，而仍有轉(zhuǎn)染活性的DNA 只有0.5%。因此，生成的磷酸鈣納米粒子的數(shù)量決定著被沉淀的DNA 的數(shù)量，從而影響DNA 的轉(zhuǎn)染效率。

圖3是不同Ca／P值的Ca－P／DNA 共沉淀中未復(fù)合DNA 的量。

圖3 Ca－P／DNA共沉淀中未復(fù)合DNA的量Fig.3 Content of unbound DNA in Ca－P／DNAco－precipitations

由圖3可看出：當(dāng)Ca／P值為50 時(shí)，超過95% 的DNA 與磷酸鈣共沉淀；當(dāng)Ca／P 值為150和500 時(shí)，約50%的DNA 未形成共沉淀。因此，Ca／P 值為50時(shí)，Ca－P／DNA 共沉淀的轉(zhuǎn)染效率最高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Ca／P 值越小，Ca－P／DNA 共沉淀的顆粒越大，其細(xì)胞毒性也越大。

2.2 脂質(zhì)體協(xié)同Ca－P／DNA 共沉淀對(duì)293T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

Lipofectamine 2000 是已經(jīng)商業(yè)化的脂質(zhì)體，其負(fù)載DNA 的轉(zhuǎn)染效率隨其用量的增加而提高（圖1），其細(xì)胞毒性也相應(yīng)升高（圖2）。當(dāng)Lipofectamine 2000 用量為1.0μL 時(shí)，基因轉(zhuǎn)染效率最高，但細(xì)胞存活率僅為60%；而當(dāng)Ca／P 值為150和500時(shí)有大量的DNA 未形成共沉淀而處于游離狀態(tài)（圖3），因此，考慮用少量的Lipofectamine 2000 來復(fù)合未沉淀的DNA，協(xié)同磷酸鈣運(yùn)載DNA 從而提高基因轉(zhuǎn)染效率并保持較低的細(xì)胞毒性。圖4 為不同用量的Lipofectamine 2000 協(xié)同Ca－P／DNA 共沉淀對(duì)293T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

圖4 不同用量的Lipofectamine 2000協(xié)同Ca－P／DNA共沉淀在293T 細(xì)胞中的熒光素酶表達(dá)Fig.4 Luciferase expression in cell 293Ttransfected with Ca－P／DNAco－precipitations in coordination with different volumes of Lipofectamine 2000

由圖4 可看出：當(dāng)Ca／P 值為50 時(shí)，加入Lipofectamine 2000 并不能提高DNA 的轉(zhuǎn)染效率；當(dāng)Ca／P值為150或500 時(shí)，隨著Lipofectamine 2000 的加入，轉(zhuǎn)染效率顯著提高1～2 個(gè)數(shù)量級(jí)，并且Lipofectamine 2000 用量超過0.2μL 后轉(zhuǎn)染效率趨于穩(wěn)定。因此，確定Lipofectamine 2000的最佳用量為0.2 μL。

Lipofectamine 2000用量為0.2μL 時(shí)，細(xì)胞存活率和未復(fù)合DNA 的量如圖5、6所示。

由圖5 可看出，當(dāng)Ca／P值為150和500時(shí)，加入0.2μL Lipofectamine 2000 細(xì)胞存活率仍然超過80%。由圖6可看出：Ca／P 值為50 時(shí)，加入0.2μL Lipofectamine 2000時(shí)未復(fù)合DNA 的量并未顯著減少；Ca／P值為150時(shí)未復(fù)合DNA 的量由43.8%降至8.5%；Ca／P值為500時(shí)未復(fù)合DNA 的量由47.8%降至24.4%。

綜上結(jié)果，當(dāng)Ca／P值為150時(shí)加入0.2μL Lipofectamine 2000為最佳基因轉(zhuǎn)染條件，此時(shí)的基因轉(zhuǎn)染效率高且細(xì)胞毒性低。

圖5 293T細(xì)胞在0.2μL Lipofectamine 2000協(xié)同Ca－P／DNA共沉淀轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞存活率Fig.5 Cell viability of cell 293Ttransfected for 48hwith Ca－P／DNAco－precipitations in coordination with 0.2μL Lipofectamine 2000

圖6 0.2μL Lipofectamine 2000協(xié)同Ca－P／DNA共沉淀中未復(fù)合DNA的量Fig.6 Content of unbound DNA in Ca－P／DNAco－precipitations in coordination with 0.2μL Lipofectamine 2000

2.3 脂質(zhì)體協(xié)同Ca－P／DNA 共沉淀對(duì)NIH3T3 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

為了進(jìn)一步考察Lipofectamine 2000協(xié)同Ca－P／DNA 共沉淀對(duì)不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率，研究了其對(duì)NIH3T3 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 Lipofectamine 2000協(xié)同Ca－P／DNA共沉淀在NIH3T3細(xì)胞中的熒光素酶表達(dá)Fig.7 Luciferase expression in cell NIH3T3transfected with Ca－P／DNAco－precipitations in coordination with Lipofectamine 2000

由圖7可知，相同條件下Lipofectamine 2000協(xié)同Ca－P／DNA 共沉淀對(duì)NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較293T 細(xì)胞（圖4）低。這可能是因?yàn)?，不同?xì)胞系特異性不一樣。但對(duì)于相同的細(xì)胞系，在不同條件下基因表達(dá)的水平應(yīng)具有相同的趨勢(shì)。從圖7 可以看出：Ca／P值為50時(shí)，Ca－P／DNA 共沉淀的轉(zhuǎn)染效率最高（A）；Ca／P 值為50 時(shí) 加入0.2μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染效率無顯著變化（A2）；Ca／P 值為150 和500時(shí)，加入0.2μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染效率顯著提高（B2、C2）。

3 結(jié)論

用少量商業(yè)化的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 復(fù)合未形成Ca－P／DNA 共沉淀的游離DNA，協(xié)同高Ca／P值的Ca－P／DNA 共沉淀提高基因轉(zhuǎn)染效率，并保持了其較低的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明：當(dāng)Ca／P值為150 時(shí)，加入0.2μL Lipofectamine 2000 可得到高基因轉(zhuǎn)染效率和低細(xì)胞毒性。這種脂質(zhì)體協(xié)同Ca－P／DNA 共沉淀技術(shù)有望在基因治療中得到廣泛應(yīng)用。

［1］WAEHLER R，RUSSELL S J，CURIEL D T.Engineering targeted viral vectors for gene therapy［J］.Nat Rev Genet，2007，8（8）：573－587.

［2］GRAHAM F L，van der EB A J.A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA［J］.Virology，1973，52（2）：456－467.

［3］ZHANG Q，ZHAO D，ZHANG X Z，et al.Calcium phosphate／DNAco－precipitates encapsulated fast－degrading polymer films for substrate－mediated gene delivery［J］.Journal of Biomedicine Materials Research B，Applied Biomaterials，2009，91（1）：172－180.

［4］MAITRA A.Calcium phosphate nanoparticles：Second－generation nonviral vectors in gene therapy［J］.Expert Review Molecular Diagnosis，2005，5（6）：893－905.

［5］KAKIZAWA Y，F(xiàn)URUKAWA S，ISHII A，et al.Organic－inorganic hybrid－nanocarrier of siRNA constructing through the selfassembly of calcium phosphate and PEG－based block aniomer［J］.Journal Controlled Release，2006，111（3）：368－370.

［6］OLTON D，LI J H，WILSON M E，et al.Nanostructured calcium phosphates（nanoCaPs）for non－viral gene delivery：Influence of the synthesis parameters on transfection efficiency［J］.Biomaterials，2007，28（6）：1267－1279.

［7］STRAIN A J，WYLLIE A H.The uptake and stability of simianvirus－40DNA after calcium phosphate transfection of CV－1cells［J］.Biochemical Journal，1984，218（2）：475－482.