（中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430074）

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（transglutaminase，TG），即蛋白質(zhì)－谷氨酸－γ－谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶（EC2.3.2.13），可以催化蛋白質(zhì)和氨基酸之間交聯(lián)、蛋白分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解以及蛋白分子內(nèi)及分子間的連接，可以改善食品結(jié)構(gòu)、提高食品彈性、保持食品營養(yǎng)。TG 可從植物、動(dòng)物、微生物中獲得［1－2］，其中微生物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（MTG）是TG 獲取的主要渠道。酶修飾法反應(yīng)條件溫和、副作用少、作用快捷安全，廣泛應(yīng)用于食品改造［3］。因此，MTG 作為一種新型的食品添加劑，在改造及生產(chǎn)新型蛋白食品方面具有良好的發(fā)展前景［4］。

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型的確定和分析在酶促反應(yīng)、突變分析、蛋白質(zhì)復(fù)合物和酶活位點(diǎn)的界面相互作用分析等方面有著重要的作用。但蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中多肽記錄的數(shù)量與結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中結(jié)構(gòu)記錄的數(shù)量都很少，需要發(fā)展計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)方法來預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。目前，三維結(jié)構(gòu)的主要預(yù)測(cè)方法有：比較建模（comparative modeling，CM）、穿線（threading）及自由建模（free modeling）。其中比較建模法是最為成功的方法，它是利用相似性的已知結(jié)構(gòu)來預(yù)測(cè)未知序列的三維結(jié)構(gòu)，而常用的就是利用網(wǎng)絡(luò)直接搜索PDB數(shù)據(jù)庫和SWISS－MODEL服務(wù)器。

作者在此根據(jù)分離得到的吸水鏈霉菌的MTG 基因，預(yù)測(cè)其三維結(jié)構(gòu)，確定其酶活中心，并構(gòu)建定點(diǎn)突變體。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌株及載體

吸水鏈霉菌（Streptomycessp.）H197菌株、質(zhì)粒pET－22b（＋）、E.coliBL21（DE3），中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室；pMD19－T，TaKaRa公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：NaCl 1%，胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，pH 值7.0。

高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基：可溶性淀粉2%，MgSO4·7H2O 0.05%，NaCl 0.05%，KNO30.1%，K2HPO40.05%，瓊脂2.5%，pH 值7.2～7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.5%，蛋白胨2.5%，酵母膏0.5%，K2HPO40.2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，CaCO30.5%，pH 值7.0。

1.1.3 試劑

BamHⅠ、HindⅢ、Amp＋、Ex－Taq 酶、pfu酶，TaKaRa 公司；凝膠回收試劑盒，Axygen 公司；DL2000DNA marker、λHindⅢ，BBI公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 引物

引物由上海生工生物工程有限公司合成，測(cè)序由擎科生物公司完成。擴(kuò)增引物f1（正向）、f2（反向）及加酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增引物F1（正向）、F2（反向）由DNAMAN5.0設(shè)計(jì)，突變引物R1（正向）、R2（反向）為PrimerX 在線設(shè)計(jì)，R1和R2是兩條互補(bǔ)的引物，在互補(bǔ)區(qū)域內(nèi)引入突變位點(diǎn)。

f1：5′－ATCCATGTACAAACGCCGGAGATT－3′f2：5′－CTTACGGCCAGCCCTGCTT－3′

F1：5′－CGAGGATCCATGTACAAACGCCGGAGATT－3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）

F2：5′－CGCAAGCTTACGGCCAGCCCTGCTT－3′（下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn)）

R1：5′－CAAAACCATATGGACCAAA·GCCAACCACTATCACG－3′（“·”標(biāo)記為突變位點(diǎn)）

R2：5′－CGTGATAGTGGTTGGCTTTGGTCCATATGGTTTTG－3′（“·”標(biāo)記為突變位點(diǎn)）

1.2 方法

1.2.1 目的基因片段的獲得

將實(shí)驗(yàn)室－70 ℃保藏的吸水鏈霉菌H197 在高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)3～4d；挑取單菌落，接種到5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、200r·min－1培養(yǎng)3～5d；再挑取單菌落，接種到20mL發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，于30℃、200r·min－1培養(yǎng)4～5d［5］；采用優(yōu)化的SDS方法［6］提取鏈霉菌總DNA，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定檢測(cè)；以其為模板，以f1、f2為引物，擴(kuò)增MTG 基因。

反應(yīng)體系（25μL）：10×PCR buffer（含Mg2＋）2.5μL，dNTP（10mmol·L－1）2μL，f1、f2（10mmol·L－1）各1.0μL，Ex－Taq酶（2.5U·μL－1）0.5μL，總DNA 1.0μL，ddH2O 17μL。

反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃5min；94 ℃40s，58 ℃60s，72℃40s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，10℃保溫20min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，大孔徑切膠回收，連接pMD19－T 載體進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 目的基因片段的序列比對(duì)及分析

將測(cè)序后的序列（完整的ORF）在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)。通過文獻(xiàn)找到這個(gè)蛋白的活性位點(diǎn)（Cys64－Asp255－His274）［7］；通過序列比對(duì)，找到目的蛋白的可能的酶活位點(diǎn)Cys151－Asp342－His361。利用ExPASy對(duì)序列進(jìn)行MTG 編碼蛋白的理化性質(zhì)分析，并在線預(yù)測(cè)MTG 的信號(hào)肽序列、糖基化位點(diǎn)。

1.2.3 目的蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過SWISS－MODEL獲取PDB格式的蛋白三維結(jié)構(gòu)［8－10］，根據(jù)數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果，在構(gòu)建的三維結(jié)構(gòu)中找到可能活性位點(diǎn)。并根據(jù)氨基酸的性質(zhì)，確定突變其中一個(gè)位點(diǎn)，研究其對(duì)酶活性的影響。

1.2.4 定點(diǎn)突變

采用重疊延伸PCR（SOE－PCR）技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變，其原理與過程見圖1。

圖1 SOE－PCR原理與過程Fig.1 Principle and process of SOE－PCR

1）以構(gòu)建的pMD19－T－MTG 質(zhì)粒作為模板，以F1、R2、F2、R1為引物，分別擴(kuò)增出上下游片段A、B。

反應(yīng)體系：10×PCR buffer（含Mg2＋）2.5μL，dNTP（10 mmol·L－1）2μL，F(xiàn)1、R2（F2、R1）（10 mmol·L－1）各1.0μL，pfu酶（2.5 U·μL－1）0.5 μL，總DNA 1.0μL，ddH2O 17μL。

反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃5min；94 ℃40s，60 ℃40s，72℃40s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，10℃保溫20min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后分別大孔徑切膠回收，－20 ℃保存。

2）將所得2份PCR 產(chǎn)物互為模板及引物，進(jìn)行第二次PCR 擴(kuò)增。

反應(yīng)體系：F1、F2（10mmol·L－1）各1.0μL，上游目的片段A 1.0 μL，下游目的片段B 1.0 μL，ddH2O 16μL，其它同第一次PCR。

反應(yīng)條件：同第一次PCR。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，大孔徑切膠回收，－20 ℃保存。

1.2.5 突變工程菌的構(gòu)建

pET－22b（＋）質(zhì)粒及PCR 產(chǎn)物的雙酶切：分別在37 ℃下用酶切體系處理pET－22b（＋）質(zhì)粒及PCR 產(chǎn)物6h，取3μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，大孔徑切膠回收，－20 ℃保存。

酶切體系：10×K buffer 5.0μL，BamHⅠ1.0 μL，HindⅢ1.0μL，ddH2O 8.0μL，pET－22b（＋）質(zhì)粒35μL（PCR 產(chǎn)物35μL），37 ℃，6h。

重組質(zhì)粒的連接：將雙酶切后的PCR 產(chǎn)物8.0 μL、線性化pET－22b（＋）質(zhì)粒5.0μL、10×T4buffer 1.5μL、ddH2O 0.5μL、T4DNA ligase 1.0μL 16 ℃過夜，采用CaCl2法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21（DE3）中，采用藍(lán)白斑法，挑取陽性菌落進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，陽性轉(zhuǎn)化子測(cè)序。

2 結(jié)果與討論

2.1 目的基因片段的檢測(cè)結(jié)果

吸水鏈霉菌H197總DNA 和MTG 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜見圖2。

由圖2a可以看到，在23kbp處有特異性片段，初步確定DNA 提取成功。由圖2b可以看到，MTG 基因擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)1 200bp左右的目的基因片段。

2.2 目的基因片段的序列比對(duì)及檢測(cè)結(jié)果

在NCBI中進(jìn)行protein blast，跟一株已知結(jié)構(gòu)的茂原鏈輪絲菌進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)茂原鏈輪絲菌基因的結(jié)構(gòu)，找到可能酶活位點(diǎn)Cys151－Asp342－His361（圖3中的方框）。圖中陰影部分為MTG 的α螺旋和β折疊區(qū)域。

圖2 吸水鏈霉菌H197總DNA（a）和MTG 基因擴(kuò)增產(chǎn)物（b）的電泳圖譜Fig.2 Electrophorogram of Streptomyces sp.H197genomic DNA（a）and PCR product of gene MTG（b）

圖3 目的基因片段序列比對(duì)Fig.3 Alignment of objective gene fragment sequence

經(jīng)ExPASy服務(wù)器在線分析MTG 的氨基酸組成，結(jié)果如表2所示。

MTG 蛋白共418 個(gè)氨基酸長度，預(yù)期大小為46 635.95Da，PI點(diǎn)為7.08，GC 含量為61.26%，通過http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP－2.0／在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽，發(fā)現(xiàn)MTG 信號(hào)肽含有29個(gè)氨基酸。通過http：／／www.cbs.dtu.dk／service／NetOGlyc／預(yù)測(cè)MTG 蛋白O－糖基化修飾位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，該序列含有蘇氨酸糖基化位點(diǎn)，但其G 值低于可被糖基化的最小閾值，所以不被糖基化。通過http：／／www.cbs.dtu.dk／service／NetNGlyc－1.0／檢測(cè)也未發(fā)現(xiàn)N－糖基化位點(diǎn)。表明表達(dá)的蛋白大小不會(huì)改變。

表2 吸水鏈霉菌H197中MTG 的氨基酸組成Tab.2 Amino acid composition of MTG from Streptomyces sp.H197

2.3 目的蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖4）

圖4 MTG 三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Three－dimensional structure prediction of MTG

通過SWISS－MODEL構(gòu)建的三維結(jié)構(gòu)模型分析，MTG 分子主要由α螺旋區(qū)（灰色）和β折疊區(qū)（黑色）構(gòu)成，α螺旋區(qū)相對(duì)分布在分子的外部，而β折疊區(qū)相對(duì)分布在分子內(nèi)部，其中兩個(gè)活性位點(diǎn)都在β折疊區(qū)。預(yù)測(cè)的活性中心在分子內(nèi)部相對(duì)靠攏，形成一個(gè)內(nèi)陷的空間。

2.4 定點(diǎn)突變

以構(gòu)建的pMD19－T－MTG 質(zhì)粒為模板，以F1、R2、F2、R1為引物，分別擴(kuò)增出上下游目的片段A、B，其中上游目的片段A 大小為1 117bp，下游目的片段B大小為186bp，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在相應(yīng)大小的位置檢測(cè)到了特異性片段（圖5a、b）。經(jīng)重疊延伸后，在1 200bp左右的位置找到了單一的目的條帶（圖5c），與預(yù)期目的片段大小相當(dāng)，初步確定已獲得目的突變片段。

圖5 目的片段A（a）、B（b）和SOE－PCR產(chǎn)物（c）的電泳圖譜Fig.5 Electrophorogram of objective fragment A（a），objective fragment B（b）and SOE－PCR product（c）

2.5 突變工程菌的構(gòu)建

將pET－22b（＋）質(zhì)粒和突變后的PCR 基因產(chǎn)物采用BamHⅠ、HindⅢ進(jìn)行雙酶切，回收酶切后的產(chǎn)物，將連接后重組質(zhì)粒pET－22b（＋）－MTG 采用CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21（DE3），使用藍(lán)白斑篩選，提取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行單、雙酶切驗(yàn)證，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，在相應(yīng)位置檢測(cè)到預(yù)期大小的目的片段（圖6）。

將突變型基因測(cè)序結(jié)果與野生型基因序列對(duì)比，在1 090位和1 092位的C均變成了A（圖7），與預(yù)期結(jié)果相同。表明已成功應(yīng)用SOE－PCR 技術(shù)進(jìn)行了突變，且突變工程菌pET－22b（＋）－MTG 已成功構(gòu)建。

圖6 單酶切及雙酶切電泳圖譜Fig.6 Electrophorogram of single enzyme digestion and double enzyme digestion

圖7 突變基因序列與野生型基因序列比對(duì)Fig.7 Alignment of mutant gene sequence and wild gene sequence

2.6 討論

定點(diǎn)突變可以便捷地改造優(yōu)化基因，是研究基因與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的重要手段之一。陳熙等［11］利用定點(diǎn)突變技術(shù)將人溶菌酶進(jìn)行定點(diǎn)突變并在真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行體外表達(dá)，得到較野生型更高活力的突變體。郝大利等［12］定點(diǎn)突變大腸桿菌aroG基因，并與trpBA基因串聯(lián)表達(dá)，獲得了高產(chǎn)色氨酸菌株。

SOE－PCR技術(shù)自1989年由Horton等構(gòu)建以來已成為主要的定點(diǎn)突變技術(shù)［13］。孫萬菊等［14］利用SOE－PCR 技術(shù)成功突變幽門螺桿菌熱休克蛋白60基因，在原核表達(dá)載體中獲得了高效表達(dá)的可溶性hsp60蛋白。在使用SOE－PCR 技術(shù)的時(shí)候應(yīng)注意DNA 聚合酶的質(zhì)量，應(yīng)避免使用普通的Taq酶，而應(yīng)使用高保真Taq酶，因?yàn)槠胀═aq酶會(huì)在PCR 產(chǎn)物的3′末端加上一個(gè)A，從而造成移碼突變，本實(shí)驗(yàn)采用的pfu高保真酶避免了此問題的發(fā)生。SOE－PCR 技術(shù)因原理簡(jiǎn)單、操作方便、適用性廣而被廣泛用于基因克隆的研究。本實(shí)驗(yàn)成功地通過SOE－PCR 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)突變，構(gòu)建了突變體。

3 結(jié)論

通過預(yù)測(cè)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的三維結(jié)構(gòu)，同源比對(duì)確定其可能的酶活中心，利用SOE－PCR 技術(shù)定點(diǎn)突變其中一個(gè)活性位點(diǎn)，并構(gòu)建了突變工程菌，為后續(xù)研究其活性位點(diǎn)的功能奠定了基礎(chǔ)。

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