（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，活性氮污染日益突出，嚴(yán)重影響人們的日常生活?；钚缘獫B透范圍較廣，不僅包括人們所熟知的水體中的NO－3－N、NO－2－N 和NH＋4－N，而且包括大氣中的氮氧化物（NOx），如NO、N2O、N2O3等。我國(guó)排放的NOx主要來(lái)源于燃煤，以NO為主，約占95%以上。

目前，各國(guó)對(duì)活性氮污染的治理進(jìn)行了深入研究，生物脫氮由于成本低及二次污染小而備受關(guān)注，已開(kāi)發(fā)出諸多脫氮工藝，如同步硝化反硝化［1］、序批式反應(yīng)器［2］、全程自養(yǎng)脫氮［3］、厭氧氨氧化［4］、高活性氨氮去除反應(yīng)器［5］等，但處理的對(duì)象主要是水體中的活性氮，對(duì)大氣中NOx的生物脫氮工藝研究相對(duì)薄弱。生物過(guò)濾系統(tǒng)［6－11］是針對(duì)NOx的生物脫氮工藝，目前還在實(shí)驗(yàn)室模擬階段，尚未有工業(yè)化應(yīng)用的實(shí)例，其原因主要有兩點(diǎn)：（1）大氣中的NOx以氣體形式存在，要進(jìn)行生物脫氮必先經(jīng)過(guò)吸附、溶解等過(guò)程，但NOx的溶解性較差，尤其是NO 幾乎不溶于水；（2）生物過(guò)濾系統(tǒng)中形成的生物膜成分復(fù)雜且受環(huán)境影響較大，因而隨著外部環(huán)境的變化，生物膜的微生物種類及其活性也發(fā)生變化，導(dǎo)致NOx去除效率波動(dòng)較大。

活性氮的去除主要是通過(guò)細(xì)菌的反硝化作用，即在相關(guān)還原酶的作用下，把NO－3最終還原成N2：NO－3→NO－2→NO→N2O→N2。NO 作為中間代謝產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞具有很大毒性，不會(huì)在細(xì)胞中積累，產(chǎn)生后會(huì)被迅速還原。而此過(guò)程由對(duì)NO 具有很高親和力的一氧化氮還原酶（Nor）完成，它催化2分子NO 形成1分子N2O［12］?？紤]到NO 的處理難度，為提高NO 的可溶性，作者在此將目的基因norB克隆至表達(dá)載體并構(gòu)建基因工程菌，使之有效表達(dá)Nor催化亞單位NorB，提高對(duì)NO 的捕獲能力，從而提高NOx的去除效率。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

銅綠假單胞菌B136－33，華南理工大學(xué)亢春喜博士惠贈(zèng)；克隆菌DH5α、表達(dá)菌BL21、質(zhì)粒pET－28a，自行保存；PCR 及相關(guān)酶切試劑，TaKaRa公司；基因組DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；SDS－PAGE相關(guān)試劑，Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

利用軟件Primer premier 5.0，根據(jù)GenBank 公布的銅綠假單胞菌B136－33norB基因序列及pET－28a上的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。上游引物：5′－CG－GAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC－3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）；下游引物：5′－CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC－3′（下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)）。上海生工生物工程有限公司負(fù)責(zé)引物合成。

1.2.2norB基因的擴(kuò)增

以試劑盒提取的基因組DNA 為模板擴(kuò)增norB片段。PCR 程序：94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性45s，55 ℃退火45s，72 ℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳后，分析PCR 產(chǎn)物。

1.2.3 質(zhì)粒pET－28a－norB及表達(dá)菌株BL21－pET－28anorB的構(gòu)建

將質(zhì)粒pET－28a及回收的norB基因片段進(jìn)行雙酶切（EcoRⅠ、HindⅢ），T4DNA 連接酶連接構(gòu)建質(zhì)粒pET－28a－norB，化學(xué)轉(zhuǎn)化至克隆菌DH5α，以卡那霉素抗性平板篩選成功的轉(zhuǎn)化子。然后將轉(zhuǎn)化子接至含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，逐步經(jīng)過(guò)菌液PCR、質(zhì)粒PCR、雙酶切及測(cè)序等鑒定程序，再把測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒pET－28a－norB化學(xué)轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL21，以卡那霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化成功的BL21－pET－28a－norB，挑選單菌落，37 ℃培養(yǎng)12h后，菌種加入15%的甘油于－80 ℃保存。

1.2.4 目的蛋白分子量的鑒定

將BL21－pET－28a－norB在LB 液體培養(yǎng)基中以250r·min－1、37 ℃培養(yǎng)約3h，至A600約為1.0時(shí)加入IPTG 誘導(dǎo)norB的表達(dá)。IPTG 誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol·L－1、1mmol·L－1，誘導(dǎo)時(shí)間1.5h，誘導(dǎo)溫度37 ℃。對(duì)誘導(dǎo)后的菌液處理后，進(jìn)行SDS－PAGE（電壓100V，30min；電壓120V，3h）電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后分析目的蛋白質(zhì)的分子量。

1.2.5 葡萄糖對(duì)norB基因表達(dá)的影響

為抑制本底表達(dá)，在LB液體培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖，按1.2.4方法進(jìn)行SDS－PAGE電泳。

2 結(jié)果與討論

2.1 norB 基因的擴(kuò)增

norB基因的PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1a。

圖1 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophorogram of PCR products

由圖1a可知，目的條帶在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中的位置與GenBank公布的norB基因大?。? 401bp）基本相符。

2.2 重組質(zhì)粒pET－28a－norB 的構(gòu)建及鑒定

從卡那霉素抗性平板上隨機(jī)挑選出10株陽(yáng)性克隆菌DH5α－pET－28a－norB，接至LB 液體培養(yǎng)基增菌后，依次進(jìn)行菌液PCR（圖1b）、質(zhì)粒PCR（圖1c），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有菌株7 為陽(yáng)性克隆菌DH5α－pET－28anorB（圖1b）。對(duì)菌株7中的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（圖1d），結(jié)果與預(yù)期完全相符（共2 個(gè)片段，大片段約5 300bp，小片段約1 400 bp）。隨后，對(duì)重組質(zhì)粒測(cè)序，并通過(guò)BLAST 分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2中灰色背景序列分別為酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和HindⅢ，波浪線序列分別為起始密碼子和終止密碼子，2個(gè)密碼子之間即為目的片段norB基因的序列，與GenBank公布序列一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒pET－28anorB構(gòu)建成功。

2.3 目的蛋白NorB分子量的鑒定

按norB基因的氨基酸序列推測(cè)，目的蛋白NorB的理論分子量約為52kDa，然而，眾多研究結(jié)果表明，NorB在SDS－PAGE 中的表觀分子量約為37～38 kDa，而由圖3可知，目的蛋白（箭頭所示）的遷移位置在40kDa附近，與NorB的表觀分子量基本相符。

圖2 重組質(zhì)粒pET－28a－norB 測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequence of recombinant plasmid pET－28a－norB

圖3 NorB的SDS－PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS－PAGE Electrophorogram of NorB

2.4 葡萄糖對(duì)norB 表達(dá)的影響

由于未加入IPTG 的重組質(zhì)粒亦表達(dá)了NorB（圖3條帶1），推測(cè)可能存在本底表達(dá)現(xiàn)象。為驗(yàn)證此現(xiàn)象，在LB液體培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖，再誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行SDS－PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可看出，葡萄糖的加入抑制了本底表達(dá)，即加入IPTG 后，在40kDa附近出現(xiàn)了目的蛋白。

2.5 討論

（1）大氣中NOx的治理是一個(gè)技術(shù)難題，其中一個(gè)重要原因就是NO 難溶于水。為提高去除效率，增大NO 可溶性就成為了一種必要手段，如Fe（Ⅱ）－EDTA 對(duì)NO 具有很好的吸收能力，但Fe（Ⅱ）－EDTA 易被氧化成Fe（Ⅲ）－EDTA，從而不能結(jié)合NO［13］，致使NO 去除率下降。為再生Fe（Ⅱ）－EDTA，Li等［14］在系統(tǒng)中加入了大腸桿菌FR－2（鐵還原細(xì)菌），并深入研究了Fe（Ⅱ）－EDTA 對(duì)Fe（Ⅲ）－EDTA 生物還原的影響。此外，從生物學(xué)角度，NO 的去除要依靠Nor的作用，Nor對(duì)NO 具有非常高的親和力，能迅速“捕捉”NO，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR 擴(kuò)增、基因克隆、表達(dá)載體構(gòu)建等，有效地表達(dá)出了Nor催化亞單位NorB，為提高NO 的去除效率奠定了理論基礎(chǔ)。

圖4 加入1%葡萄糖后的NorB的SDS－PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS－PAGE Electrophorogram of NorB supplemented with 1%glucose

（2）細(xì)菌Nor為膜結(jié)合蛋白，含有2 個(gè)亞單位，NorC和NorB，分別由基因norC和norB編碼。NorC分子量相對(duì)較小，為膜結(jié)合細(xì)胞色素c；NorB 分子量相對(duì)較大，為催化部位，由12 條跨膜α－螺旋構(gòu)成［15］，具有極強(qiáng)的疏水性，對(duì)表達(dá)極為不利。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，與其它生物脫氮中的還原酶（如亞硝酸還原酶［16］）的表達(dá)量相比，NorB 的表達(dá)量較低（圖3、4）。然而，考慮到Nor對(duì)NO 的極高親和力，即使NorB 的表達(dá)量不高，也仍然對(duì)NO 的去除具有積極的意義。

3 結(jié)論

為使norB基因得到有效表達(dá)，利用分子生物學(xué)技術(shù)將銅綠假單胞菌B136－33的norB基因克隆至表達(dá)載體pET－28a 上，并構(gòu)建基因工程菌，高效表達(dá)NorB，提高對(duì)NO 的捕獲能力，從而提高NOx的去除效率。

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