鏈霉菌Js-1T發(fā)酵條件及其對疣孢霉病的防治效果研究

李兵兵1，2，溫志強(qiáng)1*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州 350002；2.江蘇省淮安市疾病預(yù)防控制中心，江蘇淮安 223001)

摘要[目的]探討鏈霉菌Js-1T的發(fā)酵條件及防治效果。[方法]通過單因素試驗優(yōu)化鏈霉菌菌株Js-1T防治疣孢霉病的發(fā)酵培養(yǎng)基和條件，測定其發(fā)酵液對疣孢霉菌(Mycogone perniciosa)的田間防治效果。[結(jié)果] Js-1T菌株的最佳培養(yǎng)基配方為：甘露糖30.0 g，KNO3 2.0 g，MgSO4 1.5 g，K2HPO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，水1 000 ml；最佳發(fā)酵條件為：30 ℃，pH=8，250 ml三角瓶裝液量為100 ml。發(fā)酵液對疣孢霉菌的田間防治效果顯著，對Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類3個類群疣孢霉菌引起的疣孢霉病的防治效果分別達(dá)68.77%、83.84%、85.62%。[結(jié)論]鏈霉菌Js-1T在疣孢霉病防治上具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞鏈霉菌Js-1T；發(fā)酵優(yōu)化；疣孢霉菌；生物防治

中圖分類號S436.46

基金項目國家支撐計劃項目(2013BAD16B03)。

作者簡介李兵兵(1986- )，男，江蘇淮安人，碩士，從事應(yīng)用微生物學(xué)與基因工程研究。*

收稿日期2015-08-03

Optimization on Fermentation Conditions ofStreptomycesJs-1Tand Inhibition of the Fermented Liquid againstMycogoneperniciosa

LI Bing-bing1,2, WEN Zhi-qiang1*(1. Fujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou, Fujian 350002; 2. Huai’an Center for Disease Control and Prevention，Huai’an, Jiangsu 223001)

Abstract[Objective] The aim was to study fermentation conditions and control effect of Streptomyces Js-1T. [Method] In order to increase the productivity of activities substance of strain Js-1T, the composition of fermenting solution and fermenting conditions were optimized by single factor. The inhibition of its fermented liquid against Mycogone perniciosa was also tested. [Result] The optimum fermenting solution were Mannose 30.0 g, KNO3 2.0 g, MgSO4 1.5 g, K2HPO4 1.0 g, NaCl 0.1 g, and water 1 000 ml; the optimal fermenting conditions were temperature 30 ℃, pH=8, and 100 ml liquid medium in 250 ml flake. The inhibition of its fermented liquid against Mycogone perniciosa Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ were 68.77%, 83.84% and 85.62%, respectively. [Conclusion] Streptomyces strain Js-1T had certain application prospect in control of Mycogone perniciosa.

Key wordsStreptomycesstrain Js-1T; Fermenting optimization;Mycogoneperniciosa; Biological control

雙孢蘑菇疣孢霉病是由疣孢霉菌侵染引起的一種世界性病害[1-2]，近年來我國雙孢蘑菇疣孢霉病發(fā)生日趨嚴(yán)重，已成為制約我國雙孢蘑菇生產(chǎn)發(fā)展的重要因素之一[3]。目前，疣孢霉病主要使用化學(xué)藥劑來防治，但化學(xué)藥劑容易造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染。目前利用生物防治控制疣孢霉病的研究較少，蔡少芬等[4]分離到一株對疣孢霉菌有抑制作用的枯草芽孢桿菌，王勇等[5]研究發(fā)現(xiàn)裂褶菌發(fā)酵液對疣孢霉菌絲生長的抑制率達(dá)48.96%。Js-1T菌株是從銀耳栽培料中分離得到的一株鏈霉菌，初步研究發(fā)現(xiàn)該菌株對疣孢霉菌具有很強(qiáng)的抑制作用。筆者對Js-1T菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，并測定了發(fā)酵液對疣孢霉菌的防治效果，以期為Js-1T菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。鏈霉菌Js-1T菌株，從銀耳楊梅霜病發(fā)病菌筒分離獲得并保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號：CCTCCM2011365)。疣孢霉菌、雙孢蘑菇2796菌株均由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供。

1.1.2培養(yǎng)基。葡萄糖馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，水1 000 ml，pH自然。Bennett培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，酵母浸膏1.0 g，牛肉浸膏1.0 g，酶水解酪素2.0 g，水1 000 ml。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：碳源25.0 g，氮源3.0 g，MgSO41.5 g，K2HPO41.0 g，NaCl 0.1 g，水1 000 ml，pH 7。

1.2方法

1.2.1菌株活化。將Js-1T菌株接種于液體Bennett培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為160 r/min、溫度為30 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4 d。吸取50 μl培養(yǎng)好的液體菌種涂布于PDA平板上，30 ℃培養(yǎng)7 d，供試驗用。

1.2.2發(fā)酵液活性測定。以疣孢霉菌作為指示菌，采用生長速率法[5-6]測定發(fā)酵液的活性。用直徑為0.22 μm的一次性細(xì)菌過濾器過濾發(fā)酵液，取13 ml上述無菌發(fā)酵液添加到100 ml溫度為40 ℃左右的固體PDA中，充分混合均勻后倒平板。待培養(yǎng)基凝固后，接種直徑為1 cm的疣孢霉菌菌餅，每個處理5次重復(fù)。同時，以添加13 ml無菌水的培養(yǎng)基作為對照。25 ℃下培養(yǎng)，待空白對照接近長滿培養(yǎng)皿時，測量菌落半徑，并計算抑菌率。

抑制率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-原菌餅直徑)×100%[7]

1.2.3種子培養(yǎng)液的制備。用無菌接種環(huán)挑取Js-1T菌株的孢子接到裝有100 ml發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，160 r/min、30 ℃培養(yǎng)4 d。

1.2.4碳源篩選。在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加2%(W/V)的可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、甘油作為唯一碳源，按6 ml/100 ml接種量接種種子發(fā)酵液，30 ℃培養(yǎng)14 d。按照“1.2.2”方法測定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.2.5氮源篩選。在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.3%(W/V)的蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、酵母提取物作為唯一氮源，按6 ml/100 ml接種量接種種子發(fā)酵液，30 ℃培養(yǎng)14 d。按照“1.2.2”方法測定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.2.6碳源添加量試驗。將“1.2.4”篩選出的碳源按1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%(W/V)添加量加入培養(yǎng)基，按6 ml/100 ml接種量接種種子發(fā)酵液，30 ℃培養(yǎng)14 d。篩選出最適碳源添加量。

1.2.7氮源添加量試驗。將“1.2.5”篩選出的氮源按0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.6%(W/V)添加量加入培養(yǎng)基，按6 ml/100 ml接種量接種種子發(fā)酵液，30 ℃培養(yǎng)14 d。篩選出最適氮源添加量。

1.2.8溫度對發(fā)酵液活性的影響試驗。以篩選出的碳源、氮源按照最適添加量配制培養(yǎng)基，按100 ml/250 ml裝液量接種6 ml種子發(fā)酵液，分別測定20、25、28、30、35 ℃條件下發(fā)酵液的抑菌活性。

1.2.9初始pH對發(fā)酵液活性的影響試驗。將最適培養(yǎng)基的pH分別調(diào)節(jié)至5、6、7、8、9，接種6 ml種子發(fā)酵液，30 ℃恒溫培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液的pH調(diào)至中性，測定發(fā)酵液的活性。

1.2.10裝液量對發(fā)酵液活性的影響試驗。分別將50、100、150、200 ml的培養(yǎng)基裝入250 ml三角瓶中。按選出的最佳接種量接入種子發(fā)酵液，30 ℃恒溫培養(yǎng)14 d。測定發(fā)酵液的活性。

1.2.11發(fā)酵液對3個類群疣孢霉菌的田間防治試驗。分別用3個類群疣孢霉菌的孢子懸液感染雙孢蘑菇覆土，然后用Js-1T菌株發(fā)酵液處理覆土，每個處理設(shè)置20 m2的出菇面積，10 d后按5點(diǎn)取樣法統(tǒng)計新長出雙孢蘑菇子實體的病菇和健菇的數(shù)目，計算發(fā)病率和防治效果。

2結(jié)果與分析

2.1碳源篩選由圖1可知，甘油作為碳源時，發(fā)酵液對疣孢霉抑制作用最低(2.01%)；甘露糖作為碳源時，發(fā)酵液抑菌活性最高(23.43%)；其余依次為麥芽糖、淀粉、蔗糖和葡萄糖。

圖1　不同碳源對發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.2氮源篩選由圖2可見，在供篩選的4種氮源中，(NH4)2SO4、KNO32種無機(jī)氮源比有機(jī)氮源酵母提取物和蛋白胨抑菌效果好，氮源為KNO3時Js-1T菌株發(fā)酵液的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌率為15.20%。

圖2　不同氮源對發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.3碳源添加量碳源添加量對發(fā)酵液的抑菌活性有顯著影響(圖3)，添加量在10～30 g/L時，隨著添加量的增加，發(fā)酵液抑菌活性逐漸增強(qiáng)，添加量為30 g/L時發(fā)酵液抑菌活性達(dá)到最高(17.64%)。繼續(xù)添加甘露糖，發(fā)酵液抑菌活性開始下降。

圖3　甘露糖添加量對發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.4氮源添加量根據(jù)“2.2”試驗結(jié)果選擇KNO3作為氮源，添加量為2.0 g/L時，發(fā)酵液對疣孢霉抑菌效果最佳，抑菌率為20.76%(圖4)，之后隨添加量的增加，發(fā)酵液的抑菌活性開始降低。

圖4　KNO 3添加量對發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.5溫度對Js-1T菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響由圖5可知，30 ℃為Js-1T菌株發(fā)酵產(chǎn)生活性物質(zhì)的最佳溫度，此時發(fā)酵液的抑菌活性為26.28%。

圖5　溫度對發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.6初始pH對Js-1T菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響初始pH對Js-1T菌株發(fā)酵液的抑菌活性有顯著影響。在酸性和強(qiáng)堿環(huán)境中發(fā)酵液的抑菌活性較低，初始pH為8時發(fā)酵液的抑菌活性最強(qiáng)，但當(dāng)發(fā)酵液初始pH等于9時，發(fā)酵液對疣孢霉幾乎沒有抑制作用(圖6)。

圖6　初始pH對發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.7裝液量對Js-1T菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響在250 ml三角瓶中裝100 ml發(fā)酵液時，對疣孢霉菌的抑制活性最強(qiáng)，再增加裝液量，抑菌活性則降低(圖7)，說明Js-1T菌株發(fā)酵時對氧氣需求較高。因此，Js-1T菌株發(fā)酵時的裝液量選擇100 ml/250 ml。

圖7　裝液量對發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.8發(fā)酵液對3個類群疣孢霉菌的田間防治效果由表1可知，Js-1T菌株發(fā)酵液使雙孢蘑菇的疣孢霉病發(fā)病率明顯降低。其中，對疣孢霉Ⅰ類引起的栽培中雙孢蘑菇2796的防治效果相對較低，為68.77%，對Ⅱ類和Ⅲ類疣孢霉病的防治效果較高，分別達(dá)83.84%、85.62%。由此可見，Js-1T菌株發(fā)酵液在孢霉菌的防治方面具有很好的應(yīng)用價值。

3結(jié)論與討論

通過單因素篩選初步確定了Js-1T菌株發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方為：甘露糖30.0 g，KNO32.0 g，MgSO41.5 g，K2HPO41.0 g，NaCl 0.1 g，水1 000 ml；最佳發(fā)酵條件為：溫度30 ℃，pH=8，250 ml三角瓶中裝100 ml發(fā)酵液。田間防治試驗結(jié)果表明，Js-1T菌株發(fā)酵液對Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類3個類群疣孢霉菌引起的栽培中雙孢蘑菇2796的疣孢霉病的防治效果顯著，防治效果分別達(dá)68.77%、83.84%、85.62%。發(fā)酵是一個十分復(fù)雜的過程，許多因素會影響到最終試驗結(jié)果[6-7]。該研究通過單因素試驗方法確定了Js-1T菌株的最佳發(fā)酵條件，提高了Js-1T菌株代謝產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的能力，但是還需通過正交或響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件。

表1　Js-1 T菌株發(fā)酵液對3類疣孢霉菌引起雙孢蘑菇病害的防治效果

自1943年Waksman首先發(fā)現(xiàn)鏈霉菌可以產(chǎn)生鏈霉素以來，放線菌已經(jīng)成為公認(rèn)的新抗生素產(chǎn)生菌的主要來源[8]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗生素有80%以上是由放線菌產(chǎn)生的，其中又以鏈霉菌屬的菌株產(chǎn)生的最多[9]。農(nóng)用抗生素作為抗生素的一類，具有活性高、對使用環(huán)境的污染少、在環(huán)境中不易積累、來源廣、可再生等優(yōu)點(diǎn)[10]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有很好的應(yīng)用前景。Js-1T菌株是從銀耳發(fā)病菌筒中分離到的鏈霉菌，并且福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心已經(jīng)利用多相分類鑒定該菌株為鏈霉菌屬的一個新種，因此，該菌株產(chǎn)生新的抑菌活性物質(zhì)的可能性較高。從Js-1T菌株發(fā)酵液中提取、鑒定有效活性物是下一步研究的重點(diǎn)。此外，利用鏈霉菌防治疣孢霉病的研究目前尚未見報道，該試驗結(jié)果對后續(xù)發(fā)酵中試放大、有效活性物質(zhì)的分離純化以及疣孢霉病的防治具有重要意義。

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