游 偉，劉桂芬,成海建,劉曉牧，姚玉妮，宋恩亮*

（1.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟(jì)南 250100）

能繁母牛存欄水平下降給肉牛產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展帶來不利影響，造成市場(chǎng)上架子牛和犢牛貨源緊缺，而同時(shí)母牛低繁殖率制約了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，使得提高牛的繁殖率成為國(guó)內(nèi)外養(yǎng)牛業(yè)研究的熱點(diǎn)課題。母牛生雙胎或多胎是復(fù)雜的性狀，受遺傳和環(huán)境[1]兩方面因素的影響。排卵數(shù)決定了生雙胎或多胎，從表型上看屬于數(shù)量性狀或閾性狀，從微觀上看，受基因調(diào)控。排卵數(shù)受排卵前卵泡數(shù)量和質(zhì)量的影響，卵泡發(fā)育決定母牛的排卵數(shù)和胎產(chǎn)數(shù)，最終影響母牛的繁殖性能。

牛雙胎具有它的遺傳性，可通過遺傳選育來提高雙胎率，為了提高牛的雙胎率研究者已進(jìn)行了大量的研究與探索，國(guó)內(nèi)對(duì)雙胎的研究主要集中在關(guān)聯(lián)性研究方面[2-6]，至今其遺傳機(jī)制仍不清楚。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，許多激素、細(xì)胞因子和粘附因子通過內(nèi)分泌活動(dòng)與排卵聯(lián)系起來，在卵泡發(fā)育和排卵過程中發(fā)揮著非常重要的作用，如：促黃體素 （Luteotropic hormone，LH）、促卵泡素 （Follicle stimulating hormone,FSH）[7,8]、 促卵泡素受體 （Follicle stimulating hormone receptors,FSHR）[9,10]、 生長(zhǎng)和分化因子-9（Growth different-Ⅰation factor-9,GDF-9）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 15（Bone morphogenetic protein-15,BMP-15）[11-13]等。卵母細(xì)胞在調(diào)節(jié)和促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)中具有重要的作用，其所產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子主要通過旁分泌信號(hào)作用于顆粒細(xì)胞。小鼠的基因研究表明，GDF9和BMP15是卵母細(xì)胞來源的生長(zhǎng)因子，其關(guān)鍵作用在卵巢功能的調(diào)節(jié)、排卵率和生育率[14,15]。GDF和BMP15是與哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)相關(guān)的是正常生育必不可少的兩種因子，這兩個(gè)基因的大量突變已被證明與卵巢早衰和異卵雙生[12]以及增加排卵率有關(guān)[16]。在雌性小鼠卵泡發(fā)育早期GDF9基因功能喪失，將導(dǎo)致不孕不育[17]。在綿羊中，GDF9和BMP15的突變的影響敏感的拷貝數(shù)。這兩個(gè)基因的雜合突變?cè)黾与p胞胎的頻率倍數(shù)，而純合突變導(dǎo)致卵巢發(fā)育不全和不育[13,18]。這兩種因子對(duì)不同物種成功繁殖有不同程度的影響，如小鼠敲除BMP15基因表現(xiàn)出輕度降低生育率[19]，而羊BMP15基因的純合子突變形式是不育的[18,20]。在人類這兩種蛋白的異常表達(dá)都參與了卵巢早衰、孿生[21]等生殖功能。

受以上研究結(jié)果啟示，結(jié)合試驗(yàn)牛生雙胞胎家系遺傳性，對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)相關(guān)的功能基因：GDF9、BMP15、FSHβ、FSHR基因進(jìn)行多態(tài)性分析，找到八頭生雙胎牛的共同突變位點(diǎn)。分析在產(chǎn)雙胎牛和產(chǎn)單胎牛群體中對(duì)與生殖軸相關(guān)的激素水平（GH、LH、FSH、P4）的分布水平，從而了解激素對(duì)單胎妊娠和雙胎妊娠的意義以及基因突變對(duì)性激素分泌的影響，進(jìn)而為產(chǎn)雙胎牛繁殖性狀產(chǎn)生影響的分子機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在山東省魯西牛原種場(chǎng)采集到具有血緣關(guān)系的生過雙胎的魯西母牛的血液樣本共8份，以及單胎魯西母牛血樣60頭份。全部采用頸靜脈采血，用常規(guī)的酚-氯仿抽提法從血樣中提取基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)GDF9、BMP15、FSHβ和FSHR引物，擴(kuò)增出上述四種基因的全部外顯子區(qū)。引物序列及產(chǎn)物大小及退火溫度見表1。

表1 GDF9、BMP15、FSHβ和FSHR四種基因引物序列、產(chǎn)物大小及退火溫度

引物名稱 基因座 引物序列 退火溫度（℃） 片段大小（bp）FSHR-E11-1F FSHR-E11-1R FSHR-E11-2R FSHR-E11-2R FSHβ-E1F FSHβ-E1R FSHβ-E2F FSHβ-E2R FSHβ-E3-1F FSHβ-E3-1R FSHβ-E3-2F FSHβ-E3-2R BMP15-E1-F BMP15-E1-R BMP15-E2-1F BMP15-E2-1R BMP15-E2-2F BMP15-E2-2R GDF9-1F GDF9-1R GDF9-2-1F GDF9-2-1R GDF9-2-2F GDF9-2-2R GDF9-2-3F GDF9-2-3R E11-1 E11-2 E1 E2 E3-1 E3-2 E1 E2-1 E2-2 E1 E2-1 E2-2 E2-3 5'-ACTCCAAGCATAATTCCTGTTCTG-3'5'-AAGTTGTGGACCAAGTACTC-3'5'-GCTCTCAGTCTACACTCTGACCG-3'5'-ACTCCAAGCATAATTCCTGTTCTG-3'5'-TTATTTGTCCCGATCTACTGCG-3'5'-ATTTCAGAGGCCAGATGAATTG-3'5'-TGCTGGAGCAAAATATGATAAGAG-3'5'-CAAATCTGAGCCCAAACATTTAG-3'5'-CTGTAAACATTAGAGCGAGCAGT-3'5'-AGAGTTTTATCCTGTCTCCATCC-3'5'-CCTCAAAGCCTAACACTCCACAT-3'5'-AGTGACCCAAAATTTAAACGAGG-3'5'-CTTTTGTGGTAGTGGAGCCT-3'5'-ACACTTTTCTTCCCCATTTT-3'5'-AGGGCTGCTTGTCAGTTTGT-3'5'-ATGGCATGATTGGGAGAATT-3'5'-CTCGTCAAGCAGGCAGTATT-3'5'-ACTGTCTTCACCCCAAACCT-3'5'-ATTACAGAAGTGAACCTAGCCCA-3'5'-GCAAGGGCCAACTCCTTTAT-3'5'-CCACCCTGACGTTTAAGGCT-3'5'-CAGATTGAATGAAGCTGGAA-3'5'-GTGCTCAGGCTTTTCACAGG-3'5'-GAAACTTCCTCCCAAAGGCA-3'5'-ATCGAGCCTGATGGCTCAAT-3'5'-GCTTTTAGACACACTCCCTCTCC-3'54.4 51.9 59.7 56.9 55.8 54.2 55 54.1 56.5 55 58.2 55.2 56.1 56.5 57.2 56.7 55.5 55.7 56.8 55.1 56.9 50.6 56.4 54.9 56.2 58.3 401 1061 422 471 981 980 498 794 649 608 743 632 547

1.2.2 基因測(cè)序和血清激素水平檢測(cè)

對(duì)雙胎牛和單胎牛個(gè)體血樣的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交山東省農(nóng)科院測(cè)序中心直接在ABI3730自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)序。血清樣本送交北京北方生物技術(shù)研究所直接在XH6080放免儀器上采用放射免疫的方法檢測(cè)血清激素水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 GDF9、BMP15、FSHβ和FSHR基因外顯子區(qū)序列結(jié)果

對(duì)GDF9、BMP15、FSHβ、FSHR基因的全部外顯子區(qū)序列進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在GDF9、FSHβ和FSHR基因的外顯子區(qū)域，共找到7處突變位點(diǎn)，分別命名為GDF9-A99G、GDF9-G121A、FSHβ-C1126T、FSHβ-G1138A、FSHR-G1109C、FSHR-G1153A 和 FSHR-A1327T，其中在 GDF9和 FSHβ中所發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)在單胎牛和雙胎牛中均有發(fā)現(xiàn)，而在FSHR基因的第11外顯子共找到三處8頭產(chǎn)雙胎牛共同的突變位點(diǎn)。針對(duì)三個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物（引物P1 F：5’-AAGATCCTCCTGGTCCTGTT-3’，R：5’-ATTGGAACCATTAGTAACCCT-3’； 引物 P2 F：5’-CACAACTATGCCATCGACTGG-3’，R：5’-ACATTGAGCACAAGGAGGGAC-3’）在產(chǎn)單胎牛群中進(jìn)行檢測(cè)。共檢測(cè)到三處共同的突變位點(diǎn)FSHRG1109C、FSHR-G1153A和FSHR-A1327T。FSHR-P1和FSHR-P2基因座在產(chǎn)雙胎牛和產(chǎn)單胎牛中共表現(xiàn)出的基因型如圖1、圖2、圖3、圖4所示。（圖1、圖3中泳道1-8為雙胎牛，其余為單胎牛）。

圖1 FSHR基因引物FSHR-P1擴(kuò)增序列的SSCP電泳圖

圖2 FSHR基因引物FSHR-P1 SNPs的測(cè)序結(jié)果(A為單胎牛，B為雙胎牛)

圖3 FSHR基因引物FSHR-P2擴(kuò)增序列的SSCP電泳圖

圖4 FSHR基因引物FSHR-P2 SNPs的測(cè)序結(jié)果(A為單胎牛，B為雙胎牛)

2.2 上胎產(chǎn)單胎母牛和產(chǎn)雙胎母牛血清學(xué)激素水平

雙胎牛與單胎牛GH、LH、FSH、P4最小二乘均值差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，雙胎與單胎水平比較差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.148、0.331、0.090、0.058)，除P4激素單胎牛較雙胎牛略高外，產(chǎn)雙胎牛孕前血清學(xué)GH、LH、FSH這3種激素水平高于產(chǎn)單胎牛，且比產(chǎn)單胎牛高出近2倍接近（表2）。

表2 雙胎牛和單胎牛血清中GH、LH、FSH、P檢測(cè)分析

3 討論

3.1 牛FSHR基因多態(tài)性及其在產(chǎn)單、雙胎牛群體中的分布

Xiaoyu Huang等研究發(fā)現(xiàn)，大熊貓的FSHβ基因的A213T，A91G和A89C3堿基發(fā)生替換且A213T替代導(dǎo)致1個(gè)氨基酸突變（賴氨酸→蛋氨酸），大熊貓A等位基因與B等位基因相比有更好的產(chǎn)仔性狀[22]。FSHβ基因誘導(dǎo)GDF9和促性腺激素釋放激素的協(xié)同作用。Chu等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因的單核苷酸多態(tài)性在兩個(gè)高繁殖力羊品種（小尾寒羊和湖羊）和兩個(gè)低繁殖力綿羊品種（考力代和中國(guó)美利奴羊）中分布明顯不同[23]。FSHR基因編碼產(chǎn)物為疏水性跨膜蛋白，具有明顯的信號(hào)肽，其切割位點(diǎn)位于17-18位的氨基酸之間，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋與無規(guī)則卷曲為主，并主要在質(zhì)膜中發(fā)揮生物學(xué)作用，跨膜區(qū)域分為跨膜域、胞外域和胞內(nèi)域3個(gè)部分序列分析表明，F(xiàn)SHR編碼產(chǎn)物可能具有離子通道、運(yùn)載體、受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和陽離子通道等功能，在離子跨膜與信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮重要作用，并對(duì)黃牛的激素調(diào)節(jié)有影響。本研究所發(fā)現(xiàn)的FSHR-G1109C、FSHR-G1153A和FSHR-A1327T三處突變點(diǎn)在雙胎牛中分別以CC、AA、TT純合子的形式存在，在產(chǎn)單胎群體中只有2個(gè)產(chǎn)單胎牛個(gè)體在1109處是以GC雜合子的形式存在的，其它個(gè)體都是以GG的純合子形式存在，突變率僅為0.03%。因此，雙胎牛和單胎牛二者之間FSHR基因的第11個(gè)外顯子的突變率差異很大，且三處突變位點(diǎn)都在編碼區(qū)，可能對(duì)激素的調(diào)節(jié)產(chǎn)生作用，從而影響黃牛的排卵率。而GDF9-A99G、GDF9-G121A、FSHβ-C1126T和FSHβ-G1138A四處突變位點(diǎn)在雙胎牛和單胎牛中均有發(fā)現(xiàn)。表明在產(chǎn)雙胎的性狀中FSHR的三處突變位點(diǎn)起著主導(dǎo)作用，F(xiàn)SHβ基因誘導(dǎo)GDF9和促性腺激素釋放激素的協(xié)同作用，可能控制FSH、LH、P4、GH的活性，與牛產(chǎn)雙胎的繁殖性狀有一定關(guān)系，對(duì)增加生雙胎的幾率、提高牛的繁殖率有一定的可能性。

3.2 上胎產(chǎn)單、雙胎母牛血清學(xué)激素水平的分布規(guī)律

Lazaros等對(duì)FSHR的T307A不同基因型分析顯示，該突變能夠降低血清FSH水平，提高卵泡和卵母細(xì)胞的數(shù)量，增加大卵泡數(shù)量[24,25]。GDF9和BMP15 mRNA的表達(dá)水平在體外成熟水牛卵母細(xì)胞的過程中變化并且被認(rèn)為是依賴促性腺素（FSH和LH）[26]。排卵卵泡的數(shù)量與復(fù)雜的內(nèi)分泌和旁分泌途徑的調(diào)節(jié)緊密相關(guān)。其中一個(gè)重要的機(jī)制就是卵巢的TGF信號(hào)通路。GDF9和BMP15的卵母細(xì)胞的分泌是正常的人類生育必要和在確定卵泡發(fā)育和排卵率發(fā)揮重要作用。BMP-15是通過抑制FSH受體表達(dá)來抑制FSH信號(hào)傳導(dǎo)[27]。FSH和LH及其受體的表達(dá)對(duì)卵泡能否成功選擇起決定性作用[28,29]。FSH和LH濃度的相對(duì)變化、引起刺激反應(yīng)的激素濃度閾值和卵泡同期化發(fā)育程度。在高濃度的FSH作用下，大量卵泡快速生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)入選擇階段。本研究中，雙胎牛的孕前GH、LH、FSH三種激素水平高于產(chǎn)單胎牛，且與產(chǎn)單胎牛2倍接近。這可能是由于GDF9、FSHβ及FSHR基因發(fā)生突變可能導(dǎo)致蛋白表達(dá)活性和結(jié)合能力的改變，使卵泡選擇調(diào)控作用增強(qiáng)，排卵率增加。可能的調(diào)控途徑主要包括：FSHβ、GDF9和FSHR基因突變后，增強(qiáng)了FSH的表達(dá)量及其與受體的結(jié)合能力，使血液中FSH濃度有所增加，延長(zhǎng)了其在閾值以上的作用時(shí)間，使更多的卵泡能夠發(fā)育到LH依賴型；降低卵泡生長(zhǎng)發(fā)育所需要的FSH最低濃度，這樣可以使部分卵泡在較低的FSH濃度下可以接受刺激而生長(zhǎng)，產(chǎn)生更多的LH受體，能過渡到LH依賴期；在較高濃度的FSH和LH聯(lián)合作用下，卵泡同期化發(fā)育程度提高，在同一發(fā)情周期中，同步發(fā)育的卵泡數(shù)目增多。

本研究中雙胎樣本例數(shù)較少，有必要綜合雙胎妊娠的孕期指標(biāo)，了解雙胎妊娠母牛與單胎妊娠母牛GH、LH、FSH、P4水平的差別的基礎(chǔ)上聯(lián)合基因標(biāo)記，進(jìn)一步驗(yàn)證和研究，并完善產(chǎn)前和產(chǎn)后檢測(cè)和數(shù)據(jù)匯總，進(jìn)一步指導(dǎo)肉牛多產(chǎn)性的選育，將對(duì)提高牛的繁殖率具有重大意義。

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