羅超華 李 俊

凝膠柱分離純化茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的工藝優(yōu)化※

羅超華 李 俊

目的 探討一種適合產(chǎn)業(yè)化分離純化茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的工藝。方法 以葡聚糖凝膠為填料，研究中壓柱層析分離 EGCG的效果。結(jié)果 茶多酚經(jīng)脫色、過柱、凍干后得白色粉末狀固體物，經(jīng)高效液相色譜法（HPLC）檢測EGCG的純度達(dá)90%以上。結(jié)論 本工藝經(jīng)中試驗放大驗證適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

茶多酚；表沒食子兒茶素沒食子酸酯；葡聚糖凝膠；柱層析；分離純化；冷凍干燥

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是茶多酚中的一個主要生物活性成分。研究表明[1-3]，該成分具有抗腫瘤、抗白血病、抗突變、抗病毒、降血糖、降血脂等作用。因此，EGCG的提取和應(yīng)用已受到廣泛關(guān)注。但茶多酚組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)相近、極性大、水溶性好，單體的分離難度相當(dāng)大。目前，分離EGCG的方法有溶劑法、樹脂法、超臨界萃取法、高效液相色譜法（HPLC）等；但這些方法均存在一些問題，如超臨界法得率低，樹脂法所得EGCG純度不高，溶劑法步驟繁鎖，HPLC法僅用于實驗室研究應(yīng)用。相比之下，凝膠柱色譜具有得率高、純度高等優(yōu)勢。本文以方便產(chǎn)業(yè)化為思路，對凝膠柱色譜分離純化EGCG進(jìn)行工藝優(yōu)化進(jìn)行探討，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 LYO-02凍干機，上海東富龍科技有限公司產(chǎn)品；中壓色譜柱：泵EYELA VSP-3050，自動收集器EYELA DC-1200，石英玻璃柱3 cm×50 cm，均為日本東京理化產(chǎn)品；Water2695高效液相色譜儀，美國 Waters公司產(chǎn)品。

1.2 試劑 Sephadex LH-20葡聚糖凝膠，北京慧德易科技有限責(zé)任公司提供；EGCG（含量97%，批號50299-1MG-F），Sigmaaldrich公司提供，茶多酚提取物（EGCG含量40%），浙江派諾生物技術(shù)有限公司提供；甲醇（色譜純），廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測方法的建立 色譜柱：C18；流動相：甲醇∶水=40∶60；檢測波長：278 nm；流速：1 ml/min；柱溫：20 ℃。精密稱取對照品 EGCG 4.0 mg于10 ml容量瓶中，流動相溶解并稀釋至刻度，得每毫升含EGCG 0.4091 mg的對照品溶液，備用。精密吸取對照品儲備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml，分別置于5 ml容量瓶中，流動相稀釋至刻度，制成不同濃度的對照品溶液。依次取10 μl上述對照品溶液進(jìn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程。結(jié)果表明，EGCG在0.04091～0.40910 mg/ml呈良好的線性關(guān)系。其線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)為：Y=4523X－2657，r=0.9991。

2.2 脫色 茶葉中除了茶多酚，還含有大量的色素。目前國內(nèi)一般使用氯仿或離子型樹脂脫色素[4]。為尋找效果好、合適產(chǎn)業(yè)化的原料，比較離子型樹脂、氯仿、活性炭的脫色效果，發(fā)現(xiàn)活性炭脫色效果與離子型樹脂差不多，但從工藝角度考慮認(rèn)為選用活性炭更優(yōu)。

取茶多酚提取物5 g加適量水溶解，60 ℃加熱攪拌下加入茶多酚 3%量的針劑型活性炭細(xì)粉，攪拌保溫30 min，濾除活性炭，濃縮至1∶1待用。

2.3 洗脫溶劑的篩選 根椐文獻(xiàn)報道[5-7]，選用丙酮-乙醇、丙酮-水、乙醇-水、甲醇-水體、丙酮-甲醇-水系進(jìn)行對比研究。

取50 g凝膠溶脹后裝柱，分別用上述洗脫體系平衡，加入適量經(jīng)活性炭脫色的茶多酚提取物，用上述溶劑進(jìn)行洗脫，10 ml自動收集后進(jìn)行薄層色譜法（TLC）檢識，進(jìn)行單因素比較實驗，見表1。

表1 洗脫劑的篩選結(jié)果

從表1可看出，丙酮-水、乙醇-水、甲醇-水體、丙酮-甲醇-水系都可以用來洗脫，但前三者必須經(jīng)二次柱層析才能得到，而丙酮-甲醇-水則一次分離即得EGCG，因此選擇丙酮-甲醇-水為洗脫劑。

2.4 流速與載樣量的考察

2.4.1 流速的考察 取凝膠50 g，50%甲醇溶脹后裝柱，再用丙酮-甲醇-水平衡。以丙酮-甲醇-水為洗脫劑，上樣量1 g，考察0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 ml/min條件下的分離效果，以得率為縱坐標(biāo)，流速為橫坐標(biāo)作圖，當(dāng)50 g凝膠裝柱上樣量在1g丙酮-甲醇-水的洗脫速度在0.0～1.5 ml/min時EGCG得率為98%以上，當(dāng)流速＞1.5 ml/min時得率明顯下降，故流速定于1.5 ml/min，見圖1。

圖1 不同流速對EGCG得率的影響

2.4.2 載樣量的考察 以丙酮-甲醇-水為洗脫液，流速控制在1.5 ml/min，測試凝膠柱在不同載量下的分離效果，以得率為縱坐標(biāo)，載樣量為橫坐標(biāo)作圖。分離效果隨上樣量的增加而逐漸變差，當(dāng)上樣量大于3 g/100 g（以凝膠計，下同）時，分離度下降，EGCG的得率明顯降低，以生產(chǎn)實際出發(fā)，在純度與得率都比較理想情況下，上樣量定于4 g/100 g，見圖2。

圖2 不同載樣量對EGCG得率的影響

2.5 干燥方式的考察 干燥方式有真空減速壓干燥、噴霧干燥、紅外干燥等。因本產(chǎn)品附加值較高，故選擇冷凍干燥。針對EGCG的物性，制定凍干曲線。其凍干工藝為：①預(yù)凍干燥：藥液置冰箱速凍至-30℃；②升華干燥：凍干機冷凝器降溫至-40℃，抽真空至l0 Pa以下，保溫2 h后升溫到5℃，時間為8 h，到達(dá)5℃后保溫3 h；③解析干燥：5℃后升至30 ℃，時間為3 h，30 ℃后繼續(xù)保溫2 h，見圖3。

圖3 冷凍干燥程序曲線

3 討論

凝膠柱分離純化茶多酚的EGCG工藝路線為：取茶多酚加水溶解，加適量的活性炭脫色后上凝膠柱進(jìn)行分離，用丙酮-甲醇-水洗脫后據(jù)色帶收集EGCG所在部位，得富集液后適當(dāng)濃縮進(jìn)行冷凍干燥，即得純品，EGCG含量達(dá)90%以上。

在市場競爭日益激烈的當(dāng)今社會，低廉的價格與優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品能使自己在同類產(chǎn)品競爭中立于不敗之地，本實驗秉此宗旨設(shè)計合適產(chǎn)業(yè)化的研究方案。茶多酚中多酚類結(jié)構(gòu)極其相似，及多酚極性非常大的的物理性質(zhì)，是EGCG價格居高不下的原因之一。目前，大量的相關(guān)資料[5-7]均提到應(yīng)用凝膠柱色譜分離茶多酚中的EGCG，但工藝相對繁瑣。本實驗工藝中，茶多酚經(jīng)活性炭脫色后色素基本除去，在過凝膠柱時分離度大大加強，同時應(yīng)用丙酮-甲醇-水，使一次柱層析就可得到較好的EGCG純品。本工藝經(jīng)中試驗放大驗證，證明可行，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

[1]鄭紅發(fā),黃亞輝.高 EGCG茶的研究與開發(fā)[J].茶葉通訊,2007, 34(1)∶16-20.

[2]許心青,黃華濤.茶 EGCG抗癌機理研究的最新進(jìn)展[J].茶葉, 2004,30(3)∶141-142.

[3]趙麗萍,邵宛芳.茶葉中 EGCG功效研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2007,23(7)∶143-147.

[4]于華忠,張東山,龔竹瓊.茶葉中 EGCG含量分析研究[J].福建茶葉,2004(4)∶28-28.

[5]戚向陽,謝筆鈞,胡慰望.高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的分離與制備[J].精細(xì)化工,1994,11(4)∶40-40.

[6]李兆基,吳棱,康遙,等.一種茶多酚中兒茶素類化合物的分離方法∶中國,CN 1319597A,00128567.X[P].2001.11.15.

[7]姜紹通,黃靜,潘麗軍,等.兒茶素單體的分離純化方法∶中國, CN 1603319A,200410041577.3[P].2007.7.30.

Optimization of Separation and Purification for Epigallocatechin Gallate in Tea Polyphenol by Glucosan Gelatin

Luo Chaohua Li Jun

Objective To investigate the an appropriate industrialization separation and purification of EGCG from tea polyphenols.Methods Sephadex was used as filler,study the effect of EGCG medium pressure column chromatography separation.Results Tea polyphenols was processed by decolorization,column chromatography,the freezing dry white solid powder was received,the purity of EGCG is more than 90% using HPLC detection.Conclusion This process was tested in the semi-works production and was proved its suitability for industrial production.

Tea polyphenol;EGCG;Dextrane gel;Column chromatography;Separation purification;Freeze-drying

R284.2

A

1673-5846(2015)01-0017-03

南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州 510515

廣東省中醫(yī)藥局科研課題（課題編號：20122087、20132190）、南方醫(yī)科大學(xué)科研啟動計劃（B1012116）

羅超華，碩士研究生，研究方向：中藥有效成分藥理學(xué)研究。E-mail：lchua2001@163.com

李俊，講師，E-mail：pla_lijun@aliyun.com