盧 琴，李明波，彭先文，宋忠旭，雷 彬，梅書(shū)棋

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064）

豬巴氏桿菌病的病原檢測(cè)及耐藥性分析

盧 琴，李明波，彭先文，宋忠旭，雷 彬，梅書(shū)棋*

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064）

旨在對(duì)疑似豬巴氏桿菌病進(jìn)行檢測(cè)、確診，并進(jìn)行耐藥性分析，為臨床用藥和治療提供數(shù)據(jù)支撐。試驗(yàn)方法為運(yùn)用豬巴氏桿菌16S rRNA基因的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)結(jié)果，3份臨床疑似樣品中檢出2份樣品陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為66.7%。21種常用抗菌藥物的紙片法藥敏試驗(yàn)結(jié)果證明，21種藥物中，菌株對(duì)頭孢曲松、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、阿奇霉素、阿莫西林高度敏感，對(duì)克林霉素、大觀霉素、阿米卡星、四環(huán)素、新霉素等耐藥。此研究為臨床指導(dǎo)用藥提供了理論依據(jù)。

巴氏桿菌；16S?rRNA；PCR；耐藥性

巴氏桿菌是引起多種畜禽巴氏桿菌病的病原體，主要使動(dòng)物發(fā)生出血性敗血癥或傳染性肺炎。近年來(lái)隨著動(dòng)物源性巴氏桿菌強(qiáng)毒株的不斷出現(xiàn)，使巴氏桿菌的感染譜逐漸擴(kuò)大，給整個(gè)養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的損失[1-6]。目前檢測(cè)巴氏桿菌的技術(shù)手段主要有細(xì)菌分離等傳統(tǒng)的方法和分子生物學(xué)方法，后者包括種特異性PCR鑒定[7]、莢膜分型多重PCR[8]、16SrRNA基因測(cè)序法、DNA雜交大分子圖譜、限制性酶切分析和核糖體分型隨機(jī)擴(kuò)增DNA片段、ELISA、RFLP[9]等。

本試驗(yàn)對(duì)豬巴氏桿菌病的病原進(jìn)行了16SrRNA PCR鑒定，并對(duì)分離菌的耐藥性進(jìn)行了分析，此研究結(jié)果將為臨床疾病的診斷和藥物治療提供理論參考依據(jù)。

1??材料與方法

1.1?材料

1.1.1 病料

病料來(lái)源于湖北某豬場(chǎng)病豬的肺臟、心臟。

1.1.2 主要試劑

藥敏紙片，DNA提取試劑盒，DNA DL2000 Marker、DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠、Taq DNA聚合酶均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2??方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn)

將分離到的菌株在無(wú)菌條件下分別接種肉湯培養(yǎng)基，然后放入搖床中培養(yǎng)6 h，通過(guò)麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行菌液濃度的測(cè)定，調(diào)節(jié)菌液的含量為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?，按照K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)CLSI進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.2 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行

PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌16SrDNA基因序列的通用引物。上游5'-AGAG TTTGATCATGGCTCAG-3'，下游5'-GGTACCTTGTTACGACTT-3'，片段大小為457 bp。PCR體系(20μL)：模板DNA 2μL，上、下引物各1.5μL，Buffer 10μL，ddH2O5μL。 反 應(yīng) 條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸5 min。

圖1 16sRNAPCR檢測(cè)結(jié)果

2??結(jié)果

2.1??巴氏桿菌16SrDNA基因的PCR擴(kuò)增

以所提取的菌株DNA為模板，進(jìn)行巴氏桿菌16SrDNA基因的PCR擴(kuò)增。取5μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，得到了預(yù)期的457 bp的DNA條帶，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2??藥敏試驗(yàn)結(jié)果

21種藥物中，其中對(duì)頭孢曲松、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、阿奇霉素、阿莫西林高度敏感，對(duì)林可霉素、鏈霉素、乙酰螺旋霉素、頭孢拉定、卡那霉素等中度敏感，對(duì)克林霉素、大觀霉素、阿米卡星、四環(huán)素、新霉素等耐藥。

表1?藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3??討論

本研究采用通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，這為臨床快速地檢測(cè)病原提供了方便快速的方法。對(duì)疑似的病樣進(jìn)行采集檢測(cè)，為豬場(chǎng)疾病的監(jiān)測(cè)及評(píng)價(jià)疫苗免疫的好壞等進(jìn)行評(píng)估，從而更好地指導(dǎo)臨床。宋德光[10]等對(duì)東北虎巴氏桿菌病的耐藥性分析，結(jié)果表明對(duì)包括青、鏈霉素在內(nèi)的17種抗生素產(chǎn)生耐藥性，僅有3種藥物敏感，其中以新霉素高度敏感。而本實(shí)驗(yàn)中對(duì)克林霉素、阿米卡星、大觀霉素、四環(huán)素、新霉素等耐藥。這與宋德光等人的研究結(jié)果不一致，這說(shuō)明隨著抗生素的濫用，使細(xì)菌對(duì)1種甚至多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，出現(xiàn)了多重耐藥菌株并且耐藥菌株廣泛傳播[11]。針對(duì)豬場(chǎng)的實(shí)際情況，對(duì)近幾年豬巴氏桿菌病的流行情況做個(gè)趨勢(shì)圖。如以2007年1月至2011年12月豬肺疫的月發(fā)病率作為基線數(shù)據(jù)，制作豬肺疫流行控制圖，對(duì)發(fā)病強(qiáng)度做出定性預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)；應(yīng)用質(zhì)量控制圖法建立預(yù)警模型，計(jì)算預(yù)警界值，預(yù)測(cè)疾病的流行趨勢(shì)[12]。所以在臨床選用藥物時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇敏感度高、毒性小且較經(jīng)濟(jì)的藥物。對(duì)本廠所用的藥物進(jìn)行登記，必要時(shí)定期的更換，以防止動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生耐藥性。

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2015-03-27）

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD28B01)、國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-36)、湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2011-620-001-003)、湖北省高端人才引領(lǐng)培養(yǎng)計(jì)劃、湖北省公益性科技研究(2013BBB15)

盧琴（1989-），女，湖南常德人，研究實(shí)習(xí)員，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)病理學(xué)與食品安全評(píng)價(jià)。通訊作者：梅書(shū)棋。