盧 琴，李明波，彭先文，宋忠旭，雷 彬，梅書棋

（湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064）

豬巴氏桿菌病的病原檢測及耐藥性分析

盧 琴，李明波，彭先文，宋忠旭，雷 彬，梅書棋*

（湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064）

旨在對疑似豬巴氏桿菌病進行檢測、確診，并進行耐藥性分析，為臨床用藥和治療提供數(shù)據(jù)支撐。試驗方法為運用豬巴氏桿菌16S rRNA基因的通用引物進行PCR擴增檢測和藥敏試驗進行數(shù)據(jù)分析。試驗結(jié)果，3份臨床疑似樣品中檢出2份樣品陽性，陽性檢出率為66.7%。21種常用抗菌藥物的紙片法藥敏試驗結(jié)果證明，21種藥物中，菌株對頭孢曲松、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、阿奇霉素、阿莫西林高度敏感，對克林霉素、大觀霉素、阿米卡星、四環(huán)素、新霉素等耐藥。此研究為臨床指導用藥提供了理論依據(jù)。

巴氏桿菌；16S?rRNA；PCR；耐藥性

巴氏桿菌是引起多種畜禽巴氏桿菌病的病原體，主要使動物發(fā)生出血性敗血癥或傳染性肺炎。近年來隨著動物源性巴氏桿菌強毒株的不斷出現(xiàn)，使巴氏桿菌的感染譜逐漸擴大，給整個養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的損失[1-6]。目前檢測巴氏桿菌的技術(shù)手段主要有細菌分離等傳統(tǒng)的方法和分子生物學方法，后者包括種特異性PCR鑒定[7]、莢膜分型多重PCR[8]、16SrRNA基因測序法、DNA雜交大分子圖譜、限制性酶切分析和核糖體分型隨機擴增DNA片段、ELISA、RFLP[9]等。

本試驗對豬巴氏桿菌病的病原進行了16SrRNA PCR鑒定，并對分離菌的耐藥性進行了分析，此研究結(jié)果將為臨床疾病的診斷和藥物治療提供理論參考依據(jù)。

1??材料與方法

1.1?材料

1.1.1 病料

病料來源于湖北某豬場病豬的肺臟、心臟。

1.1.2 主要試劑

藥敏紙片，DNA提取試劑盒，DNA DL2000 Marker、DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠、Taq DNA聚合酶均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2??方法

1.2.1 藥敏試驗

將分離到的菌株在無菌條件下分別接種肉湯培養(yǎng)基，然后放入搖床中培養(yǎng)6 h，通過麥氏比濁管進行菌液濃度的測定，調(diào)節(jié)菌液的含量為0.5個麥氏濃度，按照K-B法進行藥敏試驗。判定標準參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會CLSI進行結(jié)果分析。

1.2.2 按照細菌基因組DNA提取試劑盒進行

PCR擴增采用細菌16SrDNA基因序列的通用引物。上游5'-AGAG TTTGATCATGGCTCAG-3'，下游5'-GGTACCTTGTTACGACTT-3'，片段大小為457 bp。PCR體系(20μL)：模板DNA 2μL，上、下引物各1.5μL，Buffer 10μL，ddH2O5μL。 反 應 條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共32個循環(huán)；72 ℃后延伸5 min。

圖1 16sRNAPCR檢測結(jié)果

2??結(jié)果

2.1??巴氏桿菌16SrDNA基因的PCR擴增

以所提取的菌株DNA為模板，進行巴氏桿菌16SrDNA基因的PCR擴增。取5μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，得到了預期的457 bp的DNA條帶，結(jié)果見圖1。

2.2??藥敏試驗結(jié)果

21種藥物中，其中對頭孢曲松、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、阿奇霉素、阿莫西林高度敏感，對林可霉素、鏈霉素、乙酰螺旋霉素、頭孢拉定、卡那霉素等中度敏感，對克林霉素、大觀霉素、阿米卡星、四環(huán)素、新霉素等耐藥。

表1?藥敏試驗結(jié)果

3??討論

本研究采用通用引物進行PCR檢測，這為臨床快速地檢測病原提供了方便快速的方法。對疑似的病樣進行采集檢測，為豬場疾病的監(jiān)測及評價疫苗免疫的好壞等進行評估，從而更好地指導臨床。宋德光[10]等對東北虎巴氏桿菌病的耐藥性分析，結(jié)果表明對包括青、鏈霉素在內(nèi)的17種抗生素產(chǎn)生耐藥性，僅有3種藥物敏感，其中以新霉素高度敏感。而本實驗中對克林霉素、阿米卡星、大觀霉素、四環(huán)素、新霉素等耐藥。這與宋德光等人的研究結(jié)果不一致，這說明隨著抗生素的濫用，使細菌對1種甚至多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，出現(xiàn)了多重耐藥菌株并且耐藥菌株廣泛傳播[11]。針對豬場的實際情況，對近幾年豬巴氏桿菌病的流行情況做個趨勢圖。如以2007年1月至2011年12月豬肺疫的月發(fā)病率作為基線數(shù)據(jù)，制作豬肺疫流行控制圖，對發(fā)病強度做出定性預測預報；應用質(zhì)量控制圖法建立預警模型，計算預警界值，預測疾病的流行趨勢[12]。所以在臨床選用藥物時，應先進行耐藥性試驗，根據(jù)試驗結(jié)果，選擇敏感度高、毒性小且較經(jīng)濟的藥物。對本廠所用的藥物進行登記，必要時定期的更換，以防止動物機體產(chǎn)生耐藥性。

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2015-03-27）

國家科技支撐計劃項目(2011BAD28B01)、國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-36)、湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心創(chuàng)新團隊項目(2011-620-001-003)、湖北省高端人才引領(lǐng)培養(yǎng)計劃、湖北省公益性科技研究(2013BBB15)

盧琴（1989-），女，湖南常德人，研究實習員，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)病理學與食品安全評價。通訊作者：梅書棋。