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(1.南華大學醫(yī)學院應用解剖研究所,湖南 衡陽 421001； 2.南華大學附屬第一醫(yī)院病理科)

·技術與方法·

酶消化法分離培養(yǎng)原代肺動脈平滑肌細胞及免疫組化鑒定

王愛平1,李嚴兵1,謝巍1,曹宇輝1,彭田紅1,周小兵,龔邵新*2

(1.南華大學醫(yī)學院應用解剖研究所,湖南 衡陽 421001； 2.南華大學附屬第一醫(yī)院病理科)

目的建立體外膠原酶消化法分離培養(yǎng)大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)及免疫鑒定的方法。方法采用I型膠原酶對PASMCs進行體外培養(yǎng)。在無菌環(huán)境下，分離提取雄性Sprague Dawley(SD)大鼠肺動脈主干，剝離外膜、剔除內皮細胞，經酶消化法，體外培養(yǎng)PASMCs。倒置相差顯微鏡觀察PASMCs生長狀態(tài)及特點；臺盼蘭測定細胞活力；免疫細胞染色法進行平滑肌α-肌動蛋白(α-SM actin)鑒定。結果酶消化法分離培養(yǎng)的PASMCs 3 d后，可見細胞貼壁呈梭形生長，6 d后生長迅速呈典型的峰-谷狀生長，9 d后達90%融合。通過形態(tài)學觀察及免疫熒光染色法鑒定表明：培養(yǎng)的細胞為PASMCs；細胞存活率為98.5%；原代培養(yǎng)8～10 d后即可傳代，3-10代細胞生長迅速、細胞形態(tài)不易發(fā)生改變，可用于進行細胞實驗。結論采用I型膠原酶消化法簡單易行、可靠、PASMCs生長迅速、傳代周期短的特點；尤為重要的是，培養(yǎng)的原代PASMCs可用于肺動脈高壓和肺血管重構的研究工作。

酶消化法； 大鼠肺動脈平滑肌細胞； 免疫細胞化學； SD大鼠

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺血管阻力的增加和肺動脈壓力持續(xù)增高為特征的進展性疾病，肺血管重構作為PAH的重要病理特征，對其機理進行深入研究有助于進一步闡述PAH的發(fā)生、發(fā)展機制[1-3]。研究表明，肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖和肥大引起的肺血管重構是導致PAH的關鍵病理因素[4,5]。由此可見，PASMCs是研究PAH發(fā)病機制和治療藥物篩選的重要手段。酶消化法是原代分離培養(yǎng)PASMCs的常用方法，但大多采用多種酶聯(lián)合消化[8,9]。本研究采用I型膠原酶消化分離PASMCs，并結合自己培養(yǎng)心得加以改進，建立SD大鼠PASMCs原代培養(yǎng)技術，旨在為進一步研究PAH的發(fā)病機制和防治藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

SPF級雄性Sprague Dawley (SD)大鼠，體重110～150 g，由南華大學實驗動物學部提供。

1.2 主要試劑

DMEM培基，胎牛血清( fetal bovine serum,FBS) 、I型膠原酶粉末、青-鏈霉素( 雙抗) 均為Hyclone產品；α-肌動蛋白單克隆抗體(α-actin) 抗體購自Abcam公司；PBS粉末購自北京鼑國生物有限公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；MTS粉末購于Promega公司；鼠二步法檢測試劑盒(PV-6001)、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋有限公司。

1.3 主要儀器

熒光倒置顯微鏡(日本OlympusBX-51)，CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，酶標儀檢測儀(德國Beckman公司)，高性能超凈工作臺(上海瑞仰凈化裝備有限公司)，離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.4 原代細胞培養(yǎng)

SD 大鼠(110～150g )實驗前禁食，自由進水。絡合碘及75%的酒精依次消毒后，頸動脈放血處死；無菌操作下迅速分離出心肺組織，仔細剝離出肺動脈主干和左右肺動脈干，將其轉移至無菌操作臺中，更換器械，置于裝有PBS的培養(yǎng)皿中，將動脈外膜纖維結締組織剝離干凈，充分漂洗之后，取出放入盛有正常培養(yǎng)基(為含有20%FBS的DMEM培基，雙抗與培基的比例為1∶100)的剝離培養(yǎng)皿中；鋒利眼科剪沿肺動脈干縱向剪開肺動脈，使內膜朝上，沿著內膜用解剖鑷來回輕刮遍數(shù)遍，去除內膜；然后用眼科剪將中膜反復剪成碎小組織塊，最后將碎塊移入預先盛有含0.1%的I型膠原酶的離心管中(酶的體積為組織塊體積的10～15倍)；將此離心管置于CO2培養(yǎng)箱中，每15～20 min輕微搖動一次，密切觀察其消化狀態(tài)，待動脈碎塊消化成透明絮狀物時(消化時間大約需2～3 h)，1 000 r/min離心5 min，棄上清液；向其加入5 mL含有20%FBS的DMEM培基，充分吹打混勻后轉移入25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后開始觀察，6天后可見細胞呈梭形，并呈“谷—峰狀”，9天后PASMCs長滿瓶底的90%，即可行傳代培養(yǎng)。

1.5 傳代培養(yǎng)

當細胞生長至培養(yǎng)瓶80%～ 90%左右融合時，往培養(yǎng)瓶內加入0.25%胰蛋白酶1mL消化細胞，顯微鏡下觀察細胞，待細胞發(fā)生皺縮變圓，細胞間隙增大時，棄掉胰酶消化液，停止消化，消化時間大約為2～3 min，再加入5 mL含20%胎牛血清的DMEM培基，多次反復輕柔吹打培養(yǎng)瓶壁，顯微鏡觀察貼壁細胞的漂浮情況，將適宜密度的細胞懸液分置于1～2個培養(yǎng)瓶，加適量20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細胞傳代至第3～11代時可用于細胞實驗。

1.6 臺盼蘭檢測PASMCs的活力

收集消化后的細胞懸液，用血細胞計數(shù)板計算細胞數(shù)。細胞懸液與0.4%臺盼蘭溶液以9∶1吹打混勻，3 min內吸取1滴用血細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞及死細胞數(shù)目，評價標準：顯微鏡下觀察，死細胞被染成藍色，而活細胞呈無色透明狀；并統(tǒng)計存活率[活細胞率%=活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù))×100%]，每管細胞懸液重復3次，取平均數(shù)為結果。

1.7 培養(yǎng)細胞的鑒定

1.7.1 活細胞形態(tài)學觀察：應用倒置相差顯微鏡觀察細胞大小、形態(tài)及生長特點。

1.7.2 α-actin免疫組化染色鑒定：將第3代細胞接種于12孔板，培養(yǎng)1～ 2天后，待細胞60%融合時；PBS漂洗2遍后，用10%的多聚甲醛固定細胞20 min，PBS漂洗后，再用0.4%Triton X-100透化處理20 min。PBS漂洗，用PV-6001試劑盒中3%H2O2室溫孵育10 min(已阻斷內源性過氧化物酶)，滴加小鼠抗大鼠α-actin一抗( 1∶100，150 μL/孔)，37 ℃孵育2 h或4度冰箱過夜 ；PBS洗凈后，滴加生物素標記的山羊抗小鼠IgG抗體，室溫放置30 min，PBS沖洗，200 μL/孔的DAB溶液顯色，蘇木素復染，倒置顯微鏡下觀察，以胞質出現(xiàn)棕黃色為陽性結果，同時計算陽性百分率。

2 結 果

2.1 PASMC的生長情況

消化分離的原代PASMC呈圓形，懸浮在DMEM培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)后2天呈分散狀貼壁生長；培養(yǎng)3天后顯微鏡下觀察貼壁的原代PASMC生長旺盛(圖1)，細胞形狀大致一致，成梭型，胞質伸展，聚集成團狀生長，但平滑肌細胞特有的“峰～谷”狀不明顯；酶消化后6天原代PASMC生長快速，基本融合成單層，成叢的緊密排列鏡下透明度及遮光性強(圖2)。

圖1 大鼠原代PASMCs(100×，原代第4天)

圖2 大鼠原代PASMCs(100 ×，原代第6天)

傳代后PASMC生長較快，傳代后2d即可融合，PASMC呈長梭型，可觀察到細胞多處區(qū)域重疊，至第3代時純度可達98%以上。

2.2 培養(yǎng)細胞臺盼蘭染色結果

臺盼藍染色后，共計數(shù)1088個細胞，其中36個為陽性細胞，約有96.7%的細胞為陰性反應，說明培養(yǎng)的PASMCs存活率較高。

2.3 PASMC的免疫細胞化學染色

取第3代的PASMCs進行α-actin免疫組化染色，于高倍鏡下可見胞核呈淡藍色，卵圓形居中，胞漿染成棕黃色，高倍鏡下可見胞漿內有大量棕色與細胞長軸平行的纖維細絲，陰性對照除未加一抗外，其余均相同；隨機選擇5個視野計數(shù)200個細胞，見4個細胞未著色，結果顯示PASMC的染色陽性率為98%，表明所培養(yǎng)的細胞是高純度的肺動脈平滑肌細胞(圖3)。

圖3 大鼠原代PASMCs鑒定(100 × ) a.陰性對照;b. Alpha-smooth muscle actin 免疫組化

3 討 論

研究結果證實，肺動脈平滑肌細胞增殖及肥大在PAH肺血管重構過程中起重要作用[6,7]。因此，進一步深入研究PASMCs在處理因素作用下的生長特點已成為目前PAH肺血管重構的攻關重點。要進行上述研究，必須首先建立肺動脈平滑肌細胞體外培養(yǎng)的方法。近年來，對PASMCs原代培養(yǎng)的研究都集中于多種酶聯(lián)合消化和貼壁法[8-10]，上述兩種方法均有經濟、方便、技術難度較低的特點，但復合膠原酶法所采用的酶數(shù)量及種類較多，較難控制消化時間，而貼塊培養(yǎng)法則周期較長。因此，通過本人的不斷探索，發(fā)現(xiàn)使用單一膠原酶消化法具有操作簡單、分離過程短、細胞存活率高等多種優(yōu)點。鑒于以上結果，本實驗研究成功建立了I型膠原酶消化法來培養(yǎng)原代PASMCs的方法。

實驗結果證明，在本研究中0.08%～0.2%范圍內膠原酶的消化濃度，以0.1%的膠原酶消化效果最好，在此濃度的膠原酶消化狀態(tài)下，細胞生長迅速，傳代周期短。同時在研究中發(fā)現(xiàn)，如果原代消化下來的細胞數(shù)少，貼壁細胞之間的間隙就比較大，預示細胞生長不良。因此，消化后細胞密度對PASMCs的生長至關重要，而細胞密度的高低主要取決于膠原酶的活性、消化時間以及剪碎組織塊的大小等因素。I型膠原酶的活性隨存放時間延長，其活性降低，因此配制好的膠原酶應盡早使用(或-20 ℃保存可達3個月)，以求最好的消化效果；消化時間是影響細胞存活能力的重要因素，消化時間過長，可導致細胞膜受損，細胞貼壁不牢，消化時間過短，細胞數(shù)量較少，細胞生長不良，因此，消化時間過長或過短都將影響分離后細胞的質量[11]；組織塊的大小大約為1mm3，過大或過小均將影響消化時間，導致細胞的存活率降低；另外，縮短取樣過程也是提高細胞活力的一個重要因素。酶消化法與傳統(tǒng)貼壁法比較操作簡單，增加了原代培養(yǎng)的細胞基數(shù)和細胞存活率，傳代后細胞生長速度快，重要的是細胞增殖代次減少，細胞變異較小，生理性狀穩(wěn)定性高。傳統(tǒng)的組織貼片法操作相對繁瑣，除延長取樣時間外，還加大污染的可能性；本研究方法從處死SD大鼠到剪段肺動脈血管結束，整個取樣過程在半小時內能完成，減少污染，更為重要的是用膠原酶消化細胞能在短時間內獲得大量細胞的特點，尤其適用于科研。PASMCs體外培養(yǎng)一個典型的特征，呈典型的“谷一峰”狀生長。本研究方法培養(yǎng)的PASMCs符合這一生長特性，因此從細胞生長特點提示，所培養(yǎng)細胞為PASMCs。

國內外研究證實，血管中的α-actin為細胞中六種肌動蛋白亞類之一，在血管平滑肌中特異性表達，具有收縮功能(SMCs具有收縮表型的重要標志物)，為肌肉細絲及細胞骨架微絲的主要成分[12,13]。本研究采用免疫細胞組化法行培養(yǎng)細胞鑒定，首先我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細胞胞漿中含有典型的與長軸平行排列的細絲，細胞呈陽性反應，然而小鼠抗大鼠α-actin在血管內皮細胞和成纖維細胞中幾乎不表達；其次細胞來源為所分離的肺動脈血管組織；以上符合肺血管平滑肌細胞的免疫細胞學結構特征，結果表明本研究方法培養(yǎng)的細胞是SD大鼠肺動脈平滑肌細胞。在傳代培養(yǎng)過程中，細胞保持著收縮表型，具有成活率高的特性，可廣泛用于PAH肺血管的重建的研究。這一方法的建立為深入研究肺動脈高壓肺血管重構的機理提供了良好的研究手段。

PASMCs是心血管疾病產生的重要病理生理基礎。本實驗方法獲取SD大鼠PASMCs方法簡單、可靠，為以PASMCs作為靶細胞提供了技術方法，尤為重要的是為研究PAH肺血管重構的機理及藥物篩選奠定基礎。

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MethodsofCultureofRatPulmonaryArterySmoothMuscleCellsandIdentification

WANG Aiping,LI Yanbing,XIE Wei,et al

(Instituteofappliedanatomy,schoolofmedicine,SouthChinauniversity)

ObjectiveTo set up the methods of rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) isolation,culture and immunological identification in vitro.MethodsThe PASMCs cultured in vitro with type I collagenase.Before the PASMCs cultured,male SD rat pulmonary trunk separated were subjected to outer membrane peel and endothelial cells remove by enzymatic digestion in a sterile environment.We observed the status and characteristics of PASMCs with inverte phase contrast microscope,determined the cell viability with trypan blue staining,and indentified the α- smooth muscle actin (α-SM actin) with immuncytochemistry staining.

ResultsThe cultured PASMCs subjected to enzymatic digestion and isolation presented shuttle shape at d 3,typical peak - valley -like growth at d6,and 90% confluence at d9.The morphological observation and immuncytochemistry staining identification showed that: the cells cultured were PASMCs; cell survival rate up to 98.5%; the primary cultures can be passaged at d8～ d10 and cells can be used for cell experiments at 3th generation to 10th for stable morphology and fast growth.ConclutionsThe method type I collagenase digestion is easy operation and reliable,the primary cultured PASMCs presented fast growt and short cell cycle can be used for pulmonary arterial hypertension and pulmonary vascular remodeling study.

Enzyme Digestion; PASMCs; SD-rat; immunocytochemistry

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.020

2014-06-07；

2014-09-28

湖南省教育廳科研項目(13C837)，湖南省科技廳項目(2014FJ3016)

*通訊作者，E-mail: sabaoth_gong@aliyun.com

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(此文編輯：秦旭平)