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(1.南華大學醫(yī)學院2009級臨床醫(yī)學專業(yè)臨改1班，湖南 衡陽 421001；2.南華大學醫(yī)學院組織胚胎學教研室)

·基礎醫(yī)學·

胃癌中葡萄糖調節(jié)蛋白78的表達及其臨床病理學意義

賀正希1，唐慧嵐1，陳景飛1，陳文琳1，蔣煒崢1，謝遠杰2*

(1.南華大學醫(yī)學院2009級臨床醫(yī)學專業(yè)臨改1班，湖南 衡陽 421001；2.南華大學醫(yī)學院組織胚胎學教研室)

目的檢測葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)在胃癌組織中的表達，分析其臨床病理學意義，探討GRP78在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法收集48例不同臨床分期及不同分化程度胃腺癌及28例癌旁正常胃黏膜組織標本，分別應用RT-PCR、Western Blotting和免疫組化檢測GRP78 mRNA和蛋白質的表達。結果與正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中GRP78 mRNA及蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)。免疫組化檢測GRP78陽性表達定位于胞漿，在正常胃粘膜組織中GRP78陽性表達率為10.7%(3/28)，高、中分化與低分化胃癌組織陽性表達率分別為59.4%(19/32)和93.8%(15/16)；直徑≥5 cm的胃癌組織中GRP78陽性表達率(88.9%,16/18)高于直徑<5 cm的胃癌組織(60%，18/30)，Ⅲ、Ⅳ期(TNM分期)病例胃癌組織中GRP78陽性表達率(90.5%，19/21)高于Ⅰ、Ⅱ期病例(55.6%，15/27)；5年內病情復發(fā)或者死亡病例胃癌組織中GRP78陽性表達率(82.8%，24/29)高于5年內病情無復發(fā)病例(52.6%，10/19)；淋巴結轉移胃癌組織中GRP78陽性表達率(96.2%，25/26)明顯高于非淋巴結轉移胃癌組織(40.9%，9/22)，各組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論GRP78在胃癌組織中高表達，其表達水平與胃癌腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移、臨床分期及預后密切相關。

胃癌； 葡萄糖調節(jié)蛋白78； 分化； 淋巴結轉移； 臨床分期

葡萄糖調節(jié)蛋白78(Glucose regulatory protein 78 KD,GRP78)是葡萄糖調節(jié)蛋白家族的重要成員，又稱為免疫球蛋白重鏈結合蛋白，它作為一種分子伴侶參與蛋白質的折疊和轉運，是正常狀態(tài)下促進蛋白質成熟、調節(jié)細胞機能的重要物質。細胞在低氧等條件下發(fā)生內質網(wǎng)應激，誘導GRP78大量表達，因此GRP78蛋白成為內質網(wǎng)應激的標志性蛋白質。近來研究發(fā)現(xiàn)在肝癌[1]、胃癌[2]、乳腺癌[3]等多種腫瘤細胞中GRP78表達增高，表明GRP78的表達可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關，但具體作用機制尚未闡明，而且目前關于GRP78在胃癌組織中表達的臨床病理意義存在分歧[4-6]。本研究通過RT-PCR、免疫組化和Western blotting等方法分別檢測GRP78 mRNA和蛋白質在胃癌組織中的表達，分析其臨床病理學意義，初步探討GRP78表達與胃癌的關系，為進一步研究GRP78在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 組織標本和主要試劑

收集2011年10月～2013年10月南華大學附屬第一醫(yī)院行胃癌根治術后并建立電話隨訪的48例病例標本(一般病理特征見表1)，癌旁正常胃黏膜組織28例(癌旁5 cm以上)，其中高、中分化胃癌32例，低分化胃癌16例；伴淋巴結轉移胃癌組織26例。手術標本取材后立即放入液氮罐保存，每例組織標本各取一部分經(jīng)甲醛固定，制成石蠟切片，組織標本其余部分分別用于提取蛋白質和RNA。所有病例均經(jīng)過病理學診斷證實，且術前均未接受放化療。蛋白裂解液、BCA蛋白質定量試劑盒、蛋白marker、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司。一步法RT-PCR試劑盒和DNA marker購自碧云天生物技術公司。PVDF膜購自Millipore，GRP78兔抗人多克隆抗體、兔抗人β-actin單抗購自博士德生物技術公司；DEPC水和Trizol購自Invitrogen，GRP78、β-actin引物由上海華美生物工程公司合成。

1.2 RT-PCR檢測胃癌組織中GRP78 mRNA的表達

取保存在液氮中各組胃組織標本，每例100 mg，采用Trizol-氯仿抽提總RNA，按RT-PCR試劑盒(Takara公司)說明合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，GRP78 Primer:fwd(5′-GCACCACCTACTCGTGCGTT-3′)rev(5′-ACCCAGGTGAGTATCTCCGTTAG-3′)，擴增片段長度為656 bp，PCR反應條件是：94 ℃ 4 min；94 ℃變性30 s,58 ℃退火60 s,70 ℃延伸2 min，36個循環(huán)；70 ℃延伸6 min。β-actin Primer:fwd(5′-TGAGACCTTCAACACGCCG-3′) rev (5′-ATGGTGATGACCTGCCCGTC-3′)，擴增片段長度為378 bp，PCR反應條件是：94 ℃ 4 min；94 ℃變性45 s,56 ℃退火60 s,72 ℃延伸1.5 min，36個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。反應后各取終產物10 μL經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察、分析實驗結果，分別測出各組胃組織中GRP78及β-actin的積分吸光度(A)值，計算兩者的比值，以此比值作為各組胃組織中GRP78 mRNA的相對表達量。

1.3 Western blotting檢測胃癌組織中GRP78蛋白的表達

提取各組胃組織標本的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，樣品和上樣緩沖液以4∶1混合，SDS-PAGE電泳后，經(jīng)半干轉膜儀轉到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h，分別加入GRP78兔抗人多克隆抗體(1∶300)和β-actin抗體(1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，HRP標記Ⅱ抗孵育1 h，TBST洗脫3次，ECL化學發(fā)光顯影，采用Quantity One軟件測定各條帶的吸光度值，分別以各條帶與β-actin(內參照)吸光度的比值表示各組GRP78蛋白的相對含量。

1.4 SP免疫組化檢測胃癌組織中GRP78蛋白的表達

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，免疫組化操作步驟按試劑盒說明進行。3%H2O2孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶，10%枸櫞酸鹽緩沖液熱修復抗原，PBS洗后正常羊血清封閉30 min，滴加1∶80 GRP78兔抗人多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，PBS清洗3 min×3次，滴加生物素化的羊抗兔Ⅱ抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗5 min×3次，經(jīng)DAB顯色，鏡下控制顯色時間，蘇木精復染，脫水，中性樹膠封片，陰性對照以PBS代替I抗，每張切片至少隨機觀察5個高倍視野，按照陽性細胞所占比例記分:≤5%為0分；6%～24%為1分；25%～50%為2分；>50%為3分。同時根據(jù)染色強度記分為:無黃色為0分；淡黃色為1分；黃色或深黃色為2分；褐色或深褐色為3分。兩項指標的積分相加結果:≤1分為陰性，>2分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件處理各組數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，多組數(shù)據(jù)間的比較行單因素方差分析，計數(shù)資料用百分比(%)表示，樣本率的比較行χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 胃癌組織中GRP78 mRNA及其蛋白的表達

RT-PCR檢測結果顯示(圖1)，正常胃黏膜組織中GRP78 mRNA相對表達量(0.10±0.02)明顯低于胃癌組織(0.97±0.10，P<0.05)。Western Blotting 檢測結果顯示(圖2)，GRP78蛋白在正常胃黏膜組織中相對含量(0.13±0.03)明顯低于胃癌組織(0.87±0.08)，差異有顯著性(P<0.05)。

圖1 RT-PCR檢測胃組織中GRP78 mRNA表達水平 T:正常胃組織；N：胃癌組織 M:DNA marker;與正常組織比較，*P<0.05

圖2 Western blotting 檢測胃組織中GRP78蛋白表達水平 T:正常胃組織；N：胃癌組織；與正常組比較，*P<0.05

2.2 胃癌組織GRP78蛋白的免疫組化表達

GRP78陽性染色為棕黃色，位于胞漿(圖3)。在正常胃粘膜組織中的陽性表達率10.7%(3/28)，高、中分化與低分化胃癌組織陽性表達率分別為59.4%(19/32)和93.8%(15/16)；在直徑≥5 cm的胃癌組織中GRP78陽性表達率(88.9%,16/18)高于直徑<5cm的胃癌組織(60%,18/30)，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期病例胃癌組織中GRP78陽性表達率(90.5%,19/21)高于Ⅰ、Ⅱ期病例(55.6%,15/27)；5年內病情復發(fā)或者死亡病例胃癌組織中GRP78陽性表達率(82.8%,24/29)高于5年內病情無復發(fā)病例(52.6%,10/19)；淋巴結轉移胃癌組織中GRP78陽性表達率96.2%(25/26)明顯高于非淋巴結轉移胃癌組織40.9%(9/22)，各組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。胃癌組織中GRP78蛋白表達情況分析見表1。

圖3 免疫組化SP法檢測GRP78在胃組織中的表達 A：正常胃組織；B：高分化胃癌組織；C：中分化胃癌組織；D：低分化胃癌組織 AL、BL、CL、DL(400×)：分別為A、B、C、D(200×)的局部放大

3 討 論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是遺傳、環(huán)境、飲食及幽門螺桿菌(HP)感染等多因素共同作用的結果，但胃癌發(fā)生、發(fā)展的具體分子機制仍未明確[7]。腫瘤從根本上說屬于基因病，探討相關基因及其蛋白質在胃癌組織中的表達，分析其臨床病理學意義，不僅為進一步研究相關基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供實驗基礎，同時也有助于揭示胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制。

近期研究表明，GRP78在人類多種腫瘤組織中高表達，而且其表達水平與腫瘤的惡性程度、轉移能力及細胞凋亡有關，抑制ERK通路能阻斷GRP78上調表達，從而促進內質網(wǎng)應激誘導的胃癌細胞凋亡[8]。GRP78的高表達與腫瘤內皮細胞的耐藥有關[9]，并且對血管生成也有一定的促進作用[10]。雖然目前關于GRP78是通過何種機制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展尚未完全明確，但其在多種腫瘤的高表達足以說明GRP78蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。因此，GRP78蛋白可能成為判斷腫瘤細胞分化程度和臨床分期的有價值的分子標記物[11]。

表1胃癌組織中GRP78蛋白表達與臨床病理特征分析

項目nGRP78陽性例數(shù)GRP78陰性例數(shù)χ2值P值性別 男37289 女11651.8320.176年齡(歲) <6023167 ≥60251870.0340.853腫瘤直徑(cm) <5301812 ≥5181624.5450.033分化程度 高、中分化321913 低分化161516.1010.014淋巴結轉移 無22913 有2625117.6040.000TNM分期 Ⅰ～Ⅱ271512 Ⅲ～Ⅳ211926.9720.0085年內病情進展 無復發(fā)19109 復發(fā)或死亡292455.0430.025

多篇文獻報道表明，在胃癌組織中GRP78表達明顯高于正常胃黏膜組織[4-6,12-13]，但目前關于GRP78在胃癌組織中表達的臨床病理意義存在分歧，姚元春等[4]認為GRP78高表達與胃癌腫瘤的大小、浸潤、轉移、分期有關，但與胃癌的分化程度無關，而余先祥等[5]認為GRP78高表達僅與胃癌的分化程度有密切關系，而與胃癌腫瘤的大小、浸潤、轉移等無關。本實驗研究結果顯示，GRP78在胃癌手術標本中的表達顯著高于正常組織，男性胃癌患者GRP78蛋白表達陽性率稍高于女性，<60歲胃癌患者稍高于≥60歲患者，但差異無統(tǒng)計學意義，表明GRP78蛋白表達與胃癌患者年齡及性別無關。但本實驗研究結果還顯示，不同分化程度的胃癌組織中GRP78表達的水平不同，低分化胃癌組織中GRP78表達陽性率明顯高于中、高分化胃癌，且低分化癌多呈強陽性表達，而在高、中分化癌中多呈弱陽性或陽性表達(圖3)。腫瘤直徑≥5 cm的胃癌組織中GRP78蛋白質表達陽性率明顯高于腫瘤直徑<5 cm的胃癌組織，淋巴結轉移胃癌組織中GRP78表達陽性率明顯高于無淋巴結轉移的胃癌組織，Ⅲ、Ⅳ期患者胃癌組織中GRP78表達陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者，表明GRP78蛋白質表達不僅與胃癌細胞分化程度有關，而且與腫瘤體積大小、淋巴結轉移及臨床分期密切相關。組織缺氧容易導致內質網(wǎng)應激，誘導GRP78的產生。由于腫瘤組織內本身存在缺氧、低糖的狀況，而隨著胃癌細胞惡性生長，腫瘤體積越大，腫瘤組織內缺氧、應激更明顯，從而導致GRP78表達越高。淋巴結轉移胃癌組織中GRP78表達陽性率明顯高于無淋巴結轉移的胃癌組織，提示GRP78可能具有促進胃癌淋巴結轉移的作用，然而關于GRP78促進胃癌淋巴結轉移的分子機制尚未明確。由于臨床分期與胃癌腫瘤大小及淋巴結轉移密切相關，因此不難理解Ⅲ、Ⅳ期患者胃癌組織中GRP78表達陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者。本研究顯示，根治術后5年內無復發(fā)的患者胃癌組織中GRP78表達陽性率明顯低于5年內復發(fā)或死亡的患者，表明GRP78蛋白質表達與患者預后密切相關。進一步研究GRP78蛋白在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制，有助于揭示胃癌發(fā)病的分子機制，為抑制GRP78基因表達作為胃癌防治的新靶點提供實驗依據(jù)。

[1] Jiang X,Kanda T,Nakamoto S,et al.Involvement of androgen receptor and glucose-regulated protein 78 kDa in human hepatocarcinogenesis[J].Exp Cell Res，2014,323(2):326-336.

[2] Yang L,Yang S,Liu J,et al.Expression of GRP78 predicts taxane-based therapeutic resistance and recurrence of human gastric cancer[J].Exp Mol Pathol，2014,96(2):235-241.

[3] Heng YZ,Cao ZG,Hu X,et al.The endoplasmic reticulum stress markers GRP78 and CHOP predict disease-free survival and responsiveness to chemotherapy in breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat，2014,145(2):349-358.

[4] 姚元春，張紅，賴麗琴.GRP78、GRP94 蛋白和mRNA 在人胃癌組織中的表達及臨床意義[J].安徽醫(yī)科大學學報，2013,48(2):152-155.

[5] 余先祥,謝本俊,張林杰.胃癌組織中GRP78的表達與臨床病理特征的相關性分析[J].安徽醫(yī)科大學學報，2012,47(6):681-683.

[6] Yang L,Yang SY,Ji JM,et al.GRP78 expression in gastric cancer and its clinical significance[J].Zhong hua Zhong Liu Za Zhi，2013,35(11):837-842.

[7] Grabsch HI,Tan P.Gastric cancer pathology and underlying molecular mechanisms[J].Dig Surg，2013,30(2):150-158.

[8] Zhang LJ,Chen S,Wu P,et al.Inhibition of MEK blocks GRP78 up-regulation and enhances apoptosis induced by ER stress in gastric cancer cells[J].Cancer Lett，2009,274(1):40-46.

[9] Visioli F,Wang Y,Alam GN,et al.Glucose-regulated protein 78 (Grp78) confers chemoresistance to tumor endothelial cells under acidic stress[J].PLoS One，2014,9(6):e101053.

[10] Dong D,Stapleton C,Luo B,et al.A critical role for GRP78/BiP in the tumor microenvironment for neovascularization during tumor growth and metastasis[J].Cancer Res，2011,71(8):2848-2857.

[11] Thornton M,Aslam MA,Tweedle EM,et al.The unfolded protein response regulator GRP78 is a novel predictive biomarker in colorectal cancer[J].Int J Cancer，2013,133(6):1408-1418.

[12] Bai Z,Ye Y,Liang B,et al.Proteomics-based identification of a group of apoptosis-related proteins and biomarkers in gastric cancer[J].Int J Oncol，2011,38(2):375-383.

[13] Wu JY,Cheng CC,Wang JY,et al.Discovery of tumor markers for gastric cancer by proteomics[J].PLoS One，2014,9(1):e84158.

TheExpressionandClinicalPathologicalSignificancesofGRP78inHumanGastricCancerTissues

HE Zhengxi,TANG Huilan,CHEN Jingfei,et al

(ClassOneforClinicalMedicalReforminGrade2009ofMedicalSchool,UniversityofSouthChina，Hengyang,Hunan421001，China)

ObjectiveTo explore the role of GRP78 in the development of gastric carcinoma by analysis of the expression of GRP78 in gastric carcinoma tissue.Methods48 cases of human gastric carcinoma tissue with different clinical period and differentiation degree and 28 cases of normal gastric tissue were selected.The mRNA and protein of GRP78 were detected by RT-PCR,Western blotting and immunohistochemistry,respectively.ResultsCompared with normal gastric epithelial tissue，the expression of GRP78 at mRNA and protein level in gastric carcinoma tissue increased significantly,which were showed by RT-PCR and Western Blotting(P<0.05).GRP78 protein was mainly distributed in cytoplasm showed by immunohistochemistry.The positive rate of GRP78 in normal gastric tissue,well or moderately-differentiated and poorly-differentiated gastric cancer tissue were 10.7% (3/28),59.4% (19/32) and 93.8% (15/16),respectively.The positive rate of GRP78 in gastric carcinoma tissue with diameter ≥5 cm was 88.9%(16/18),at Ⅲ,Ⅳ period in TNM staging was 90.5% (19/21),and with recurrence or death less than 5 years was 82.8% (24/29),which were higher than that with diameter < 5 cm(60%,18/30),at Ⅰ,Ⅱ period (55.6%,15/27),and with relapse-free in five years(52.6%,10/19),respectively.The positive rate of GRP78 in gastric carcinoma tissue with lymphatic metastasis was 96.2% (25/26)，which was much higher than that of without lymphatic metastasis (40.9%,9/22).ConclusionThe expression of GRP78 in gastric cancer tissue increased,and GRP78 was involved in the development and progression of gastric cancer,which was highly related to tumor size,differentiation,lymph node metastasis,clinical stage and prognosis of gastric cancer.

gastric carcinoma; glucose regulatory protein 78 KD; differentiation; lymph node metastasis; clinical stage

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.005

2014-08-06；

2014-11-20

本項目受2012年湖南省大學生研究性學習和創(chuàng)新性實驗計劃項目及2012年地方高校國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201210555017)資助.

*通訊作者，E-mail:charlesking8888@163.com.

R735.2

A

(此文編輯：蔣湘蓮)