謝為天，劉穎，徐春厚(廣東海洋大學，廣東湛江524088)

殼聚糖是一種天然高分子絮凝劑，無毒副作用，不會造成二次污染。殼聚糖與海藻酸鈉交聯(lián)后形成的縮聚物具有更優(yōu)良的絮凝和吸附性能，常被用于污水的凈化處理，在食品發(fā)酵工業(yè)上也常用于除去發(fā)酵液中的菌體，近來也被用于生產益生菌的研究［1－7］。由于鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液pH介于3～4，而黃豆?jié){中大豆蛋白的等電點約為pH 4.5，帶正電荷的大豆蛋白質膠體微粒與帶負電荷的細菌發(fā)生凝聚而沉淀析出［9－12］。筆者以殼聚糖－海藻酸鈉和黃豆?jié){為絮凝劑，研究鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液的絮凝效果，為該益生菌的液體培養(yǎng)與菌體收集提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 鼠李糖乳桿菌LT22，由廣東海洋大學預防獸醫(yī)學實驗室分離、鑒定和保存。

1.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基 組成為蛋白胨12 g、牛肉浸膏10 g、酵母浸膏4 g、葡萄糖20 g、無水乙酸鈉3 g、檸檬酸氫二銨2 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、MnSO4·H2O 0.1 g、吐溫-80 0.6 g、蒸餾水1 000 ml，pH 6.2 ～6.4，每瓶分裝 250 ml，115 ℃滅菌20 min。

1.3 絮凝劑的配制

1.3.1 濃度1.5%殼聚糖溶液。取殼聚糖1.5 g，加濃度1%醋酸溶解100 ml溶解，115℃滅菌20 min。

1.3.2 濃度1.0%海藻酸鈉溶液。取海藻酸鈉1.0 g，加蒸餾水100 ml，溶解，用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調pH至7.6，115℃滅菌20 min。

1.3.3 黃豆?jié){。取黃豆100 g，置于300 ml蒸餾水中浸泡，6 h后磨制成豆?jié){，過濾，離心，去除沉淀后補充水至300 ml，115℃滅菌20 min。

1.4 絮凝發(fā)酵菌液 將鼠李糖乳桿菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h，連傳2代;第2代鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)物即為絮凝發(fā)酵菌液，備用。

1.5 殼聚糖－海藻酸鈉絮凝試驗

1.5.1 試驗設計。用殼聚糖和海藻酸鈉二因子三水平數(shù)的一般全因子試驗設計(表1)，設3個重復。

1.5.2 絮凝方法。將250 ml絮凝發(fā)酵菌液置于燒杯中，在磁力攪拌下緩慢加入海藻酸鈉溶液，攪拌均勻后加入殼聚糖溶液，繼續(xù)攪拌20 min，靜置2 h。取絮凝后的發(fā)酵菌液液面下2 cm處上清液，用生理鹽水進行10倍倍比稀釋。取適當稀釋度溶液，測定吸光值(A600)，即為絮凝后上清液吸光值。

1.5.3 絮凝效果評價。用沉降率評價殼聚糖和海藻酸鈉絮凝劑對鼠李糖乳桿菌的絮凝效果。

沉降率(%)=(1－絮凝后上清液吸光值/混合絮凝發(fā)酵菌液吸光值)×100

按試驗設計將不同添加量的殼聚糖溶液和海藻酸鈉溶液與絮凝發(fā)酵菌液混合，攪拌均勻，立即用生理鹽水進行10倍倍比稀釋，取適當稀釋度溶液測定吸光值(A600)。

1.6 黃豆?jié){絮凝試驗

1.6.1 試驗設計。采用三因子數(shù)和三水平數(shù)的一般全因子設計，設3個重復。

1.6.2 絮凝方法。將250 ml絮凝發(fā)酵菌液置于三角瓶中，緩慢加入黃豆?jié){，搖勻，在不同溫度的恒溫箱中靜置一定時間，絮凝后上清液吸光值測定同“1.5.2”。

1.6.3 絮凝效果評價。評價方法同“1.5.3”，只是將其中的殼聚糖和海藻酸鈉絮凝劑換成黃豆?jié){絮凝劑。在不同添加量的黃豆?jié){與絮凝發(fā)酵菌液混合后，立即用酸度計測定pH。

1.7 數(shù)據(jù)處理 用Minitab15軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖－海藻酸鈉溶液對發(fā)酵菌液的絮凝效果 殼聚糖與海藻酸鈉溶液不同水平組合對鼠李糖乳桿菌絮凝效果見表1和圖1。

由表1和圖1、2可知，當殼聚糖與海藻酸鈉的添加量在6～8 ml時，菌體沉降率處于最大值的深綠色區(qū)域;當殼聚糖添加量固定為3 ml時，菌體沉降率在海藻酸鈉添加量為3 ml時有最大值(89.45%)，且隨著海藻酸鈉添加量的增加而明顯下降;當殼聚糖添加量固定為6 ml時，菌體沉降率在海藻酸鈉添加量為6 ml時有最大值(90.35%)，且隨著海藻酸鈉添加量的增加或減少均明顯下降。

2.2 黃豆?jié){對發(fā)酵菌液的絮凝效果 由表2和圖3、4可知，影響菌體沉降率最大的因素為絮凝時間和絮凝溫度。黃豆?jié){的添加量對沉降率的影響有隨添加量的增加而增大的趨勢，但效果不顯著;菌體沉降率大于80%的發(fā)酵液pH均處于3.65～3.82之間，當發(fā)酵液 pH大于3.82時，菌體沉降率均低于70%。可見，發(fā)酵液與豆?jié){混合時的pH對鼠李糖乳桿菌的絮凝效果有明顯的影響。

表2 黃豆?jié){對發(fā)酵菌液的絮凝效果

3 討論

3.1 殼聚糖－海藻酸絮凝劑 殼聚糖－海藻酸鈉具有凝聚鼠李糖乳桿菌的良好性能。在250 ml鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液中添加濃度1.5%殼聚糖溶液和濃度1.0%海藻酸鈉溶液的體積為6～8 ml時，鼠李糖乳桿菌的絮凝沉淀率達90.35%。魯詩鋒等［13］考察了12種絮凝劑或沉淀劑對1，3-丙二醇發(fā)酵液的絮凝處理的效果，發(fā)現(xiàn)殼聚糖效果最佳，對發(fā)酵液中菌體的去除率達99.97%。張江紅等［14］用殼聚糖、海藻酸鈉復合絮凝劑處理2，3-丁二醇發(fā)酵液去除其中菌體，絮凝率達98%。由此可知，殼聚糖-海藻酸鈉絮凝劑具有絮凝細菌的良好效果。但是，用這種復合絮凝劑凝聚沉淀得到菌體難以分散，至于其是否影響益生菌在動物生產上的使用效果有待進一步的研究。

3.2 黃豆?jié){絮凝劑 黃豆?jié){在最適條件下對鼠李糖乳桿菌的絮凝沉淀率達87.49%，比應用殼聚糖-海藻酸鈉復合絮凝劑的菌體沉淀率稍低，但黃豆?jié){作為絮凝劑收集到的活菌體具有良好的分散性，對益生菌的生產較有利，而且大豆蛋白對活菌體起營養(yǎng)和保護作用。

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