黃金海，陳振，孫燕，劉德華

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克雷伯氏肺炎桿菌LDH526產(chǎn)1,3-丙二醇的甘油自動(dòng)流加策略

黃金海，陳振，孫燕，劉德華

清華大學(xué)化學(xué)工程系應(yīng)用化學(xué)研究所，北京 100084

黃金海, 陳振, 孫燕, 等. 克雷伯氏肺炎桿菌LDH526產(chǎn)1,3-丙二醇的甘油自動(dòng)流加策略. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(10): 1520–1527.Huang JH, Chen Z, Sun Y, et al. Automatically feeding strategy for 1,3-propanediol fermentation of Klebsiella pneumoniaeLDH526. Chin J Biotech, 2015, 31(10): 1520–1527.

1,3-丙二醇是一種重要的化工原料，主要作為平臺(tái)化合物用于合成聚酯，如聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯。經(jīng)基因工程改造的克雷伯氏肺炎桿菌LDH526能以甘油作為唯一碳源合成1,3-丙二醇，最終發(fā)酵濃度超過90 g/L。甘油濃度是影響1,3-丙二醇合成的關(guān)鍵因素。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)甘油濃度的精確控制，設(shè)計(jì)并優(yōu)化了基于發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的甘油自動(dòng)流加策略。通過將底物流加速率與易觀察變量pH和發(fā)酵時(shí)間偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵過程中甘油流加的自啟動(dòng)和甘油濃度的動(dòng)態(tài)控制。發(fā)酵72 h，1,3-丙二醇的濃度可穩(wěn)定超過95 g/L。自動(dòng)控制甘油流加的發(fā)酵過程具有可重復(fù)性、連續(xù)性以及人工工作量少的特點(diǎn)，有望從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模擴(kuò)大到生產(chǎn)規(guī)模。

克雷伯氏肺炎桿菌，1,3-丙二醇，流加策略，自動(dòng)控制

1,3-丙二醇 (1,3-Propanediol，簡(jiǎn)稱PDO) 是一種重要的平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于聚酯、食品、醫(yī)藥、化妝品、溶劑等行業(yè)[1-2]。1,3-丙二醇最重要的用途是作為單體用于合成聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯 (PTT)，PTT是一種新型的聚酯化學(xué)纖維，在工程塑料、紡織、家具和地毯等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，發(fā)展前景廣闊[3-5]。1,3-丙二醇的合成方法有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法[6]。微生物發(fā)酵法利用可再生資源生產(chǎn)1,3-丙二醇具有許多優(yōu)點(diǎn)，如反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、原料可再生且價(jià)格低廉等，受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注[4-7]。

在天然的PDO生產(chǎn)菌株中，克雷伯氏肺炎桿菌是最具生產(chǎn)潛力的菌株之一[8-9]。本研究組自主篩選的克雷伯氏肺炎桿菌HR526[10]是目前文獻(xiàn)報(bào)道的PDO高產(chǎn)菌株之一，PDO最終發(fā)酵濃度可超過90 g/L。在利用克雷伯氏肺炎桿菌發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的過程中，甘油濃度的精確調(diào)控是影響PDO合成的重要因素之一[11]。甘油濃度過高會(huì)引起中間代謝產(chǎn)物3-羥基丙醛 (3-HPA) 的高濃度積累，3-HPA具有細(xì)胞毒性，能抑制菌體的生長(zhǎng)和甘油的代謝，導(dǎo)致發(fā)酵過程的異常終止[12-14]。降低甘油濃度可以降低3-HPA的積累，但較低的甘油濃度同時(shí)會(huì)降低PDO的合成速率和最終產(chǎn)量。以3-HPA的濃度為指導(dǎo)，可以控制甘油濃度在合適的范圍內(nèi)，防止3-HPA的積累，保證發(fā)酵過程的安全性并提高PDO的產(chǎn)量[11]。由于甘油濃度不能在線檢測(cè)，人工反饋流加補(bǔ)料工作量大，因此，建立合適的甘油自動(dòng)流加策略對(duì)于PDO的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。在補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中，常見的底物濃度控制策略有恒速流加、脈沖流加、指數(shù)流加[15-16]等。相比于開環(huán)控制，存在反饋?zhàn)饔玫拈]環(huán)模型可以精確控制底物濃度，如pH反饋模型[17-18]、生物量反饋模型[17]、溶氧(DO) 反饋模型[18]、底物直接反饋模型[19]及pH和生物量二元函數(shù)模型[20]等。本文采用的菌株為克雷伯氏肺炎桿菌HR526乳酸缺陷菌株LDH526[21]，由于不同菌株發(fā)酵特性不同，采用上述流加方式在LDH526的流加發(fā)酵過程中都不能很精確地控制甘油濃度，滿足發(fā)酵過程的要求。針對(duì)克雷伯氏肺炎桿菌LDH526的發(fā)酵特性，本研究根據(jù)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，將甘油流加速率與堿液流加速率和發(fā)酵時(shí)間相偶聯(lián)，提出了甘油的自動(dòng)流加策略并搭建了自動(dòng)流加裝置，實(shí)現(xiàn)了甘油流加的自啟動(dòng)和甘油濃度的精確控制。

1 模型建立

1.1 底物流加自啟動(dòng)模型的建立

在補(bǔ)料分批發(fā)酵中，底物流加通常是在初始底物接近消耗完全時(shí)人工開啟。由于甘油濃度不能快速在線檢測(cè)，人工操作難以合適地把握甘油的流加時(shí)機(jī)。通過觀察底物不足時(shí)的現(xiàn)象，本文建立了在特定甘油濃度下開啟甘油流加的自啟動(dòng)模型。當(dāng)甘油不足時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)代謝減緩，產(chǎn)酸速率降低，在pH恒定的發(fā)酵過程中，對(duì)應(yīng)的堿液流加速率下降。通過在線檢測(cè)堿泵開度值，當(dāng)堿泵開度下降并且達(dá)到某個(gè)數(shù)值時(shí)開啟甘油流加，實(shí)現(xiàn)在合適的甘油濃度范圍內(nèi)開啟甘油流加。

1.2 底物流加速率模型的建立

根據(jù)微生物基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)[22]，基質(zhì)消耗分別用于細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成和維持代謝：

根據(jù)宋志遠(yuǎn)等[20]的推導(dǎo)和簡(jiǎn)化，底物流加速率1(g/h) 與堿液流加速率2(g/h) 和生物量的關(guān)系為：

其中、、為常數(shù)，通過發(fā)酵數(shù)據(jù)擬合得到。

在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生物量可采用指數(shù)生長(zhǎng)模型表示：

在穩(wěn)定期，為常數(shù)，令，得到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期的底物流加模型：

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用菌種為實(shí)驗(yàn)室自主篩選和改造的克雷伯氏肺炎桿菌乳酸缺陷株LDH526。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[11]，發(fā)酵培養(yǎng)基初始甘油濃度為20 g/L，使用前均在121 ℃下滅菌20 min。

2.1.1 種子培養(yǎng)

在LB斜面30 ℃活化種子12 h，再接種于含100 mL種子培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，在37 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)12 h。

2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵在5 L自控pH發(fā)酵罐中進(jìn)行，裝液量為4 L，接種量1% (/)，溫度37 ℃，攪拌速度250 r/min，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的NaOH溶液維持pH為6.5，通氣量0.5 vvm。在人工反饋補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，每隔一段時(shí)間檢測(cè)甘油濃度，根據(jù)甘油濃度和甘油消耗量調(diào)整甘油流加速率，控制甘油濃度在合適的范圍內(nèi)。

甘油自動(dòng)流加發(fā)酵實(shí)驗(yàn)采用甘油流加與堿液流加和發(fā)酵時(shí)間相偶聯(lián)的變速流加方式。流加裝置簡(jiǎn)易圖見圖1。發(fā)酵罐通過pH電極2在線檢測(cè)pH值，堿液流加泵4自動(dòng)流加堿液維持pH的恒定。計(jì)算機(jī)記錄并存儲(chǔ)堿泵開度值，通過流加模型自動(dòng)控制底物流加泵5，從而實(shí)現(xiàn)甘油流加的自動(dòng)化。

圖1 甘油自動(dòng)流加發(fā)酵裝置

2.1.3 分析方法

菌體濃度以650表示，底物甘油及代謝產(chǎn)物1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸和乙醇濃度采用高效液相色譜測(cè)定，測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[23]。

發(fā)酵生產(chǎn)PDO的中間代謝產(chǎn)物3-羥基丙醛采用比色法測(cè)定，測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[24]。

3 結(jié)果與討論

在克雷伯氏肺炎桿菌LDH526產(chǎn)1,3-丙二醇的過程中，發(fā)酵的順利進(jìn)行及PDO的最終濃度與甘油的流加速率和3-HPA的積累密切相關(guān)。以3-HPA的濃度為指導(dǎo)，前期的人工補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵過程中合適的甘油濃度進(jìn)行了探索，結(jié)果表明，甘油流加存在3個(gè)關(guān)鍵階段：在發(fā)酵前期 (6?10 h)，初始甘油接近消耗完成，3-HPA逐漸積累。菌體在該階段對(duì)甘油濃度非常敏感，稍高的甘油濃度即導(dǎo)致3-HPA的高濃度積累，因此，必須在合適的時(shí)間節(jié)點(diǎn)以合適的速度開啟甘油流加，保證甘油濃度在1?3 g/L之間；在發(fā)酵的第二階段 (10?14 h)，3-HPA積累接近峰值，甘油濃度需要控制在較低的濃度 (6 g/L以下)；在發(fā)酵的第三階段 (14?24 h)，3-HPA的積累減弱，需要逐漸提高甘油濃度以促進(jìn)PDO的合成。由于人工反饋控制存在延遲性，無法保證每批次發(fā)酵的順利進(jìn)行，并且存在重復(fù)性差、工作量大等問題，本文針對(duì)甘油流加時(shí)機(jī)和流加速率進(jìn)行深入的研究。

3.1 甘油流加的自啟動(dòng)

在甘油流加開啟時(shí) (6?7 h)，初始甘油接近消耗完成 (甘油濃度在1 g/L左右)，流加過早開啟會(huì)導(dǎo)致甘油濃度維持在較高水平，3-HPA迅速積累。流加開啟滯后，較低濃度的甘油在極短時(shí)間內(nèi)即消耗完成，出現(xiàn)底物不足現(xiàn)象，直接影響菌體的發(fā)酵性能和PDO的最終產(chǎn)量。在人工補(bǔ)料反饋調(diào)節(jié)中，通過不斷檢測(cè)甘油濃度，推斷甘油消耗速率來開啟甘油流加，該方法不僅工作量大，而且由于檢測(cè)的延遲性以及不同批次發(fā)酵條件的不平行性，不能實(shí)現(xiàn)甘油流加在合適的時(shí)機(jī)開啟。

在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)孜锊蛔銜r(shí)，菌體生長(zhǎng)和代謝變緩，產(chǎn)酸速率變慢，堿液流加速率下降。當(dāng)?shù)孜餄舛葹榱銜r(shí)，菌體停止產(chǎn)酸，堿液流加泵停止加堿。堿液流加速率間接反映了發(fā)酵液中甘油濃度的變化。通過采集堿泵開度，得到堿泵開度平均值隨時(shí)間的變化曲線 (圖2)。從圖中可以看出，在批式發(fā)酵中，隨著產(chǎn)酸量的增大，堿泵的開度隨之增大，在6 h (360 min) 左右達(dá)到最大值；當(dāng)?shù)孜锊蛔銜r(shí)，堿泵的開度迅速下降；隨著甘油流加的開啟，堿泵的開度又迅速上升。

通過在流加開啟時(shí)機(jī) (6?7 h) 附近密集取樣并檢測(cè)甘油濃度，發(fā)現(xiàn)甘油濃度在1 g/L左右時(shí)，堿泵開度值下降到最大值的80%?85%。因此，研究中設(shè)定當(dāng)堿泵開度下降到最大值的85%時(shí)，通過計(jì)算機(jī)控制，自動(dòng)開啟甘油流加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到6.5?6.8 h，甘油流加自動(dòng)開啟，相應(yīng)時(shí)刻的甘油濃度維持在0.53?1.22 g/L之間，從而保證了發(fā)酵的順利進(jìn)行。

圖2 堿泵開度隨時(shí)間變化曲線

圖3 流加時(shí)機(jī)附近甘油濃度變化曲線

3.2 底物流加模型參數(shù)的確立

根據(jù)多批次人工反饋補(bǔ)料發(fā)酵數(shù)據(jù)，利用0?14 h的值，得到菌體指數(shù)增長(zhǎng)的擬合公式為：

不同時(shí)期的甘油消耗速率擬合公式為：

在發(fā)酵的穩(wěn)定期，通過調(diào)整公式(8) 中常數(shù)項(xiàng)的大小，可以實(shí)現(xiàn)甘油濃度以不同的速率增加。

3.3 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期流加模型的驗(yàn)證

在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，3-HPA極易積累，必須控制甘油的流加速率，使甘油維持在較低濃度(6 g/L以下)。甘油流加自動(dòng)開啟后，采用公式(7) 流加甘油。在不同批次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期甘油流加自動(dòng)控制結(jié)果如圖4所示。由圖4A可知，甘油濃度在批式發(fā)酵的終點(diǎn) (第7 h左右) 達(dá)到較低水平 (1 g/L左右)，通過開啟甘油流加，甘油濃度逐漸上升，7?12 h維持在1?3 g/L，14 h上升至5?6 g/L。對(duì)比人工反饋調(diào)節(jié)結(jié)果，自動(dòng)流加控制的甘油濃度變化更加平穩(wěn)，3-HPA的濃度 (數(shù)據(jù)未列出) 維持在較低水平，保證了發(fā)酵過程的安全性。由圖4B可以看出，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PDO以較快的速率增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果超過人工反饋調(diào)節(jié)的最佳結(jié)果，說明甘油濃度在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期得到合理控制。

圖4 6?14 h甘油濃度(A) 和PDO濃度(B)隨時(shí)間的變化

3.4 穩(wěn)定期不同甘油濃度發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

在發(fā)酵穩(wěn)定期，3-HPA的積累下降，甘油濃度的變化不會(huì)造成菌體的死亡，但甘油濃度影響PDO的生成速率，逐漸提高甘油濃度有利于促進(jìn)PDO的合成。人工補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，發(fā)酵進(jìn)行到14?16 h，650達(dá)到最大值 (650為12?14)，此后細(xì)胞即進(jìn)入穩(wěn)定期。為了研究發(fā)酵穩(wěn)定期甘油流加的合適速率，調(diào)整式(8) 中常數(shù)項(xiàng)的大小，改變發(fā)酵液中的甘油濃度。以650達(dá)到最大值的時(shí)間點(diǎn)為對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的分界點(diǎn)，分別考察甘油以3種不同速率提高時(shí)PDO合成的變化。如圖5A所示，1、2、3批次分別對(duì)應(yīng)以下3種甘油流加速率：1) 甘油濃度以恒定速率1 g/(L·h) 提高，即=8.20時(shí)；2) 不斷改變值，使甘油濃度以較快速率增長(zhǎng)，而又不至于出現(xiàn)3-HPA的積累；3) 甘油濃度以恒定速率2 g/(L·h) 提高，即=12.20。圖5B中PDO濃度的變化表明穩(wěn)定期時(shí)逐漸提高甘油濃度有利于PDO的生成，過低和過高的甘油濃度都不利于PDO的快速積累。當(dāng)甘油濃度以恒定速率2 g/(L·h) 提高，穩(wěn)定期甘油濃度維持在20?40 g/L時(shí)，PDO增長(zhǎng)速率較快，72 h時(shí)PDO的濃度達(dá)95.25 g/L。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過合理地選擇時(shí)間節(jié)點(diǎn)并調(diào)整式 (8) 中的常數(shù)項(xiàng)，可以實(shí)現(xiàn)甘油濃度以合適的速率增加，保證穩(wěn)定期甘油濃度在合適的范圍內(nèi)。

圖5 甘油 (A) 及對(duì)應(yīng)的PDO (B) 濃度隨時(shí)間的變化

3.5 甘油自調(diào)控條件下副產(chǎn)物的分布

整個(gè)發(fā)酵過程中，采用自動(dòng)控制裝置分兩階段流加甘油，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 (7?14 h) 使甘油濃度保持在較低水平 (6 g/L以下)。從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期過渡到穩(wěn)定期時(shí)，甘油濃度穩(wěn)步上升(至20 g/L左右)，穩(wěn)定期甘油濃度維持在20?40 g/L，最終PDO產(chǎn)量在95 g/L以上，甘油的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.51?0.54，與Homann等[8]報(bào)道的值相當(dāng)。整個(gè)發(fā)酵過程中，各種主要產(chǎn)物 (PDO、2,3-BDO、乙酸、丁二酸、乙醇) 的合成如圖6所示。結(jié)果顯示，副產(chǎn)物2,3-BDO的濃度在33 g/L左右，丁二酸濃度和乙酸的濃度分別在18 g/L和8 g/L左右，乙醇在5 g/L左右。前期發(fā)酵實(shí)驗(yàn)還表明，穩(wěn)定期控制甘油濃度在較低水平 (10?15 g/L)，乙醇的生成量增加，最高可達(dá)17 g/L左右，相應(yīng)的甘油摩爾轉(zhuǎn)化率降低為0.47。因此，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期至穩(wěn)定期提高甘油濃度，不僅有利于PDO的快速生成，也有利于減少副產(chǎn)物的積累，提高甘油轉(zhuǎn)化率。而在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，必須防止3-HPA的積累，故控制甘油濃度在較低水平。由于該時(shí)間段非常短 (7 h左右)，因此對(duì)整個(gè)過程副產(chǎn)物的分布影響很小。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以3-HPA和PDO的濃度來指導(dǎo)甘油濃度的控制，在穩(wěn)定期，以副產(chǎn)物和PDO生成速率來確定甘油的濃度范圍，既可以保證發(fā)酵過程的順利進(jìn)行，又可以進(jìn)一步降低副產(chǎn)物的產(chǎn)量，提高甘油的轉(zhuǎn)化率。

圖6 自動(dòng)控制甘油流加發(fā)酵過程中PDO、2,3-BDO、乙酸、丁二酸和乙醇濃度隨時(shí)間的變化

4 結(jié)論

本文基于對(duì)克雷伯氏肺炎桿菌LDH526發(fā)酵特性的研究，提出了批式發(fā)酵過程中的甘油自動(dòng)流加策略。根據(jù)堿液流加速率的變化，設(shè)定堿泵開度下降到最大值的80%?85%時(shí)，開啟甘油流加，實(shí)現(xiàn)了甘油流加的自啟動(dòng)。由于菌體在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期對(duì)甘油濃度要求不同，采用兩段流加模型自動(dòng)控制甘油濃度在合適的范圍內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了整個(gè)發(fā)酵過程中甘油流加的全自動(dòng)，最終PDO的產(chǎn)量在95 g/L以上。與國(guó)內(nèi)報(bào)道的甘油流加策略[19-20]相比，本文基于克雷伯氏肺炎桿菌LDH526的發(fā)酵特性，甘油流加分兩段控制：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期要求較低的甘油濃度，允許波動(dòng)范圍小 (1?3 g/L)，而其他文獻(xiàn)報(bào)道的甘油濃度控制在較大范圍 (10?20 g/L)；發(fā)酵穩(wěn)定期通過提高甘油的流加速率，PDO的終產(chǎn)量超過95 g/L，這一產(chǎn)量遠(yuǎn)高于其他文獻(xiàn)報(bào)道值，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果將有望從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模擴(kuò)大到生產(chǎn)規(guī)模。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

Automatically feeding strategy for 1,3-propanediol fermentation ofLDH526

Jinhai Huang, Zhen Chen, Yan Sun, and Dehua Liu

Institute of Applied Chemistry, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China

1,3-propanediol is an important chemical used as building block for the synthesis of highly promising polyesters such as polytrimethylene terephthalate. A genetically modifiedLDH526 can use glycerol as sole carbon source and produce 1,3-propanediol with the titer above 90 g/L. A key factor affecting the production of 1,3-propanediol by the mutantis the accurate control of the feeding of glycerol. To generate a robust and reproducible fermentation process of 1,3-propanediol, we designed and optimized an automatically feeding strategy of glycerol based on fermentation kinetics. By coupling the substrate feeding rate with easily observed variables -pH and fermentation time, we have achieved self-starting glycerol feeding and dynamic control of the glycerol concentration during the fermentation process. This automated system allowed us to generate a reproducible, consistent and operator-independent process from lab-scale to production scale. The final concentration of 1,3-propanediol was above 95 g/L after 72 h.

, 1,3-propanediol, feeding strategy, automatic control

10.13345/j.cjb.140550

November 16, 2014; Accepted:February 26, 2015

National Natural Science Foundation of China (No. 21406131).

Zhen Chen. Tel/Fax: +86-10-62782654; E-mail: zhenchen2013@mail.tsinghua.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 21406131) 資助。

2015-03-25

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150325.1121.002.html