楊麗紅，郝秀萍，丁紅香，金艷慧，江明華，王明山

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗中心，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心，浙江 溫州 325027）

·臨 床 經(jīng) 驗·

兩個γTrp208Leu雜合突變導(dǎo)致的遺傳性低纖維蛋白原血癥家系表型和基因型分析

楊麗紅1，郝秀萍1，丁紅香2，金艷慧1，江明華2，王明山1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗中心，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心，浙江 溫州 325027）

目的：對由同一突變位點導(dǎo)致的兩個遺傳性低纖維蛋白原血癥家系進(jìn)行臨床表型和基因型分析，探討其分子發(fā)病機(jī)制。方法：檢測兩個家系所有成員的血漿凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）、纖溶酶原活性（PLG∶C）和纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（FDPs），分別采用Clauss法與免疫比濁法測定血漿纖維蛋白原活性（Fg∶C）和抗原（Fg∶Ag）水平。提取DNA，PCR擴(kuò)增Fg的FGA、FGB和FGG基因所有外顯子和側(cè)翼序列，PCR產(chǎn)物純化后測序進(jìn)行基因分析。采用Swiss-Model和PIC軟件對突變位點進(jìn)行蛋白模型和氨基酸相互作用的分析。結(jié)果：兩家系先證者PT、APTT以及纖溶指標(biāo)（PLG∶C和FDPs）均在正常范圍內(nèi)，TT輕度延長；Fg∶C明顯降低，分別為0.49 g/L和0.63 g/L；Fg∶Ag同步下降，分別為0.64 g/L和0.77 g/L。先證者A的奶奶和父親，先證者B的母親、阿姨和表弟，F(xiàn)g∶C和Fg∶Ag均有不同程度降低?；蚍治霭l(fā)現(xiàn)2例先證者FGG基因第7號外顯子5792位發(fā)生G＞T雜合錯義突變，導(dǎo)致Fg γD結(jié)構(gòu)域的208位色氨酸突變?yōu)榱涟彼幔é肨rp208Leu）。模型分析顯示γTrp208Leu突變破壞了Trp208與Thr314間的天然氫鍵連接，并使該位點氨基酸側(cè)鏈變短，空間構(gòu)型改變，使突變蛋白穩(wěn)定性下降。結(jié)論：纖維蛋白原FGG基因γTrp208Leu雜合錯義突變是導(dǎo)致該兩個遺傳性低纖維蛋白原血癥的原因。

遺傳性低纖維蛋白原血癥；纖維蛋白原；突變；雜合子；模型分析

遺傳性低纖維蛋白原血癥（inherited hypofibrinogenemia）是由纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)g）基因缺陷導(dǎo)致血漿Fg活性（fibrinogen activity，F(xiàn)g∶C）和抗原（fibrinogen antigen，F(xiàn)g∶Ag）同步降低的遺傳性疾病?；颊叨鄶?shù)無臨床癥狀，少數(shù)表現(xiàn)出血、血栓形成、自發(fā)性流產(chǎn)等癥狀，一般出血癥狀與血漿Fg水平有關(guān)[1-2]。無臨床癥狀患者常于手術(shù)前進(jìn)行凝血功能篩查時被發(fā)現(xiàn)。本研究對由同一個基因位點雜合突變導(dǎo)致的兩個無親緣關(guān)系遺傳性低纖維蛋白原血癥家系進(jìn)行表型診斷和基因突變分析，以探討該疾病的分子發(fā)病機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 一般資料

1.1.1 家系資料：家系A(chǔ)先證者，男，13歲，溫州市瑞安人，因包皮環(huán)切手術(shù)于2014年7月來溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診，術(shù)前凝血功能檢查發(fā)現(xiàn)凝血酶時間（thrombin time，TT）延長（為27.8 s/17.0 s），F(xiàn)g∶C和Fg∶Ag明顯降低（分別為0.49 g/ L和0.64 g/L）。家系B先證者，男，19歲，溫州市樂清人，因甲狀腺結(jié)節(jié)于2013年12月來溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診，術(shù)前凝血功能檢查TT延長（為27.6 s/17.0 s），F(xiàn)g∶C和Fg∶Ag明顯降低（分別為0.63 g/L和0.77 g/L）。2例先證者延長的TT均不能被硫酸魚精蛋白校正試驗糾正，其他凝血、纖溶指標(biāo)均無明顯異常，肝腎功能正常。經(jīng)家系調(diào)查，先證者A及其家系成員自訴平時均無自發(fā)出血癥狀，其父親于5年前行包皮環(huán)切術(shù)時未見出血異常；先證者B自訴平時也無自發(fā)出血癥狀，但靜脈穿刺后止血時間較長，其母親和阿姨分娩時出血量較多。兩個家系間無親緣關(guān)系，遺傳家系圖譜見圖1。

圖1 兩個遺傳性低纖維蛋白原血癥家系圖

1.1.2 正常對照組：選取2014年8月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心健康體檢者150例為正常對照組，其中男62例，女88例，年齡18～57歲，平均（36±9.4）歲，均無肝、腎功能疾病，無出血與血栓史。所有受試者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：采集所有受試成員的外周靜脈血標(biāo)本，以0.109 mol/L枸櫞酸鈉1∶9抗凝，3 000 r/ min離心10 min，血漿用于凝血、纖溶等表型指標(biāo)檢測；下層血細(xì)胞于-40 ℃凍存，用于基因組DNA提取。

1.2.2 血漿表型指標(biāo)檢測：凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、TT、Fg∶C和纖溶酶原活性（plasminogen activity，PLG∶C），用STA-R全自動血凝儀及配套試劑（法國STAGO公司）檢測。血漿Fg∶Ag和纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（fibrinogen degradation products，F(xiàn)DPs）在LX-20全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter公司，試劑由浙江伊利康生物技術(shù)有限公司提供）上用免疫比濁法檢測。

1.2.3 Fg基因分析：用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物工程有限公司）抽提外周血細(xì)胞的基因組DNA。根據(jù)Fg的Genbank序列M64982、M64983和M10014，應(yīng)用Premier 5.0TM軟件設(shè)計覆蓋FGA、FGB、FGG基因所有外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列的23對引物（上海桑尼生物科技有限公司合成）。PCR體系為50 μL，包括Taq PCR MasterMix（含染料）25 μL、雙蒸水18 μL、DNA模板3 μL和上下游引物各2 μL。PCR反應(yīng)在ABI 2720 PCR儀（美國Applied Biosystems公司）上進(jìn)行，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，56～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送上海桑尼生物科技有限公司用ABI 3730測序儀（美國Applied Biosystems公司）進(jìn)行正、反向測序。測序結(jié)果在Chromas軟件中與基因庫序列（M64982、M64983、M10014）進(jìn)行比對。明確先證者基因突變位點后，擴(kuò)增家系其他成員的相應(yīng)區(qū)域并測序分析。

1.2.4 突變結(jié)構(gòu)和模型分析：基于已知的Fg結(jié)構(gòu)模型，采用Swiss-Model（http∶//swissmodel.expasy.org/）構(gòu)建蛋白空間模型，并利用PIC（Protein Interactions Calculator，http∶//pic.mbu.iisc. ernet.in/）分析蛋白內(nèi)氨基酸的相互作用。

2 結(jié)果

2.1 家系表型檢測結(jié)果 家系A(chǔ)先證者（ III2）PT和APTT正常，TT延長，為27.8 s，F(xiàn)g∶C和Fg∶Ag明顯降低，分別為0.49 g/L和0.64 g/L；其奶奶（I2）和父親（ II1）TT均延長，F(xiàn)g∶C和Fg∶Ag表現(xiàn)為不同程度的降低。家系B先證者（ III2）PT和APTT正常，TT延長，為27.6 s，F(xiàn)g∶C和Fg∶Ag明顯降低，分別為0.63和0.77 g/L；其母親（ II2）、阿姨（ II3）和表弟（ III3）TT均延長，F(xiàn)g∶C和Fg∶Ag表現(xiàn)為不同程度的降低。兩個家系其他成員的Fg∶C和Fg∶Ag均在正常范圍。兩個家系所有成員的其他凝血、纖溶指標(biāo)均無異常（見表1）。

2.2 家系基因檢測結(jié)果 對兩個家系先證者Fg的FGA、FGB和FGG基因外顯子和側(cè)翼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，發(fā)現(xiàn)兩先證者均在FGG基因第7號外顯子的5792位發(fā)生G＞T雜合錯義突變，導(dǎo)致Fg γD結(jié)構(gòu)域的208位色氨酸突變?yōu)榱涟彼?，即γTrp208Leu，其他外顯子和側(cè)翼序列的測序結(jié)果正常（見圖2）。家系A(chǔ)的奶奶和父親，家系B的母親、阿姨和表弟均攜帶g.5792 G＞T雜合突變，兩家系的其他成員均為正常野生型（見表1）。查閱文獻(xiàn)該突變位點國內(nèi)鮮見報道。

表1 兩個家系成員的表型及基因型檢測結(jié)果

2.3 突變結(jié)構(gòu)和模型分析 Trp208位于Fg γ鏈D結(jié)構(gòu)域α-螺旋結(jié)構(gòu)的起始位置，屬于非極性的疏水性氨基酸。運用Swiss-Model和PIC軟件進(jìn)行模型構(gòu)建和突變后氨基酸相互作用的比對分析，在野生型蛋白中，主鏈-主鏈間Trp208與Asn207、Gln210、Tyr211、Lys212形成4個氫鍵；主鏈-側(cè)鏈間Trp208與Thr314、Asp316形成2個氫鍵。當(dāng)Trp208突變?yōu)橥瑸榉菢O性氨基酸的Leu時，與Thr314的氫鍵連接斷裂，其他5個天然氫鍵未受到破壞；氨基酸突變側(cè)鏈變短形成一個空隙，使空間構(gòu)象發(fā)生變化（見圖3）。

3 討論

圖2 Fg FGG第7號外顯子基因測序結(jié)果

圖3 FGG Trp208Leu突變模型分析

Fg又稱為凝血因子I，由定位于4q28-4q31的三個獨立基因FGA、FGB、FGG編碼產(chǎn)生Aα、Bβ、γ三條多肽鏈，通過二硫鍵連接成對稱性的二聚體（AαBβγ）2結(jié)構(gòu)[3]。在凝血酶作用下，F(xiàn)g分別從Aα鏈及Bβ鏈的氨基末端水解下纖維蛋白肽A及纖維蛋白肽B形成單體，暴露出聚合位點，在活化凝血因子X III的作用下，形成纖維蛋白網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)直接參與止血。Fg還是血小板膜糖蛋白 IIb/ IIIa的受體，介導(dǎo)血小板活化聚集，參與一期白色血栓形成。因此Fg異常將直接影響機(jī)體正常的止、凝血功能，與出血性及血栓性疾病密切相關(guān)[4]。

FGA、FGB和FGG基因缺陷導(dǎo)致Fg數(shù)量和/或功能異常是導(dǎo)致遺傳性纖維蛋白原缺陷癥的主要分子基礎(chǔ)。自1935年報道首例遺傳性低纖維蛋白原血癥以來，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)250余種Fg的基因突變（http∶// site.geht.org），大部分以點突變?yōu)橹?，其次為小片段缺失或插入，其中以位于Aα鏈的FGA基因突變占多數(shù)[5]。Fg基因缺陷可影響其蛋白表達(dá)、與凝血酶和血小板糖蛋白的結(jié)合位點、纖維蛋白單體的聚合和穩(wěn)定性，通過纖維蛋白肽釋放異常、纖維蛋白單體聚合和交聯(lián)異常、纖維蛋白凝塊纖溶異常等機(jī)制影響Fg的正常功能[6]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)2例均由γTrp208Leu錯義突變引起的低纖維蛋白原血癥。兩個家系中，先證者均于術(shù)前凝血功能篩查時發(fā)現(xiàn)Fg∶C明顯降低（分別為0.49 g/L和0.63 g/L）、Fg∶Ag同步下降（分別為0.64 g/L和0.77 g/L），肝腎功能和纖溶指標(biāo)正常，且兩個家系中均有相似成員，臨床診斷為I型遺傳性纖維蛋白原缺陷癥的低纖維蛋白原血癥。在兩個家系中存在γTrp208Leu突變的低纖維蛋白原血癥成員中，家系A(chǔ)的先證者與其父親均無自發(fā)出血癥狀；家系B的先證者平時止血時間較長，其母親和阿姨無自發(fā)出血癥狀，但分娩時出血量較多；2例先證者手術(shù)中均無異常出血。本研究兩家系由相同位點的雜合錯義突變導(dǎo)致，但家系成員的臨床出血表現(xiàn)不盡相同，這與文獻(xiàn)報道的該疾病臨床表現(xiàn)多樣性符合，可能與疾病的顯性雜合狀態(tài)復(fù)雜性或協(xié)同其他因素有關(guān)[7-8]。

Fg的γD結(jié)構(gòu)域是多個配體的結(jié)合位點，其中包括凝血酶作用位點、凝血因子X III結(jié)合位點和血小板膜糖蛋白 IIb/ IIIa結(jié)合位點等。Trp208正位于此結(jié)構(gòu)域α-螺旋的起始位置，經(jīng)物種的蛋白同源性比對分析，此位點在物種間呈高度保守?？梢奣rp208突變可能對Fg的結(jié)構(gòu)和功能起重要作用。本研究用Swiss-Model和PIC軟件對該突變位點進(jìn)行蛋白空間的模型分析和突變后氨基酸間相互作用發(fā)現(xiàn)：在野生型蛋白中，Trp208在主鏈-主鏈間形成4個天然氫鍵（Asn207、Gln210、Tyr211、Lys212），在主鏈-側(cè)鏈間形成2個天然氫鍵（Thr314、Asp316），維持著Fg此區(qū)域的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；當(dāng)Trp208突變?yōu)橥瑸榉菢O性氨基酸的Leu時，主鏈間的氫鍵連接未發(fā)生變化，但與Thr314的氫鍵連接斷裂。通過模型分析可見，Trp208分別與Thr314、Asp316通過氫鍵連接形成一個β折疊，維持該轉(zhuǎn)折處空間構(gòu)型的穩(wěn)定性。Trp208突變破壞了與Thr314的氫鍵連接，使該β折疊的穩(wěn)定性下降。并且208位點氨基酸的改變也影響了和該區(qū)域鄰近氨基酸間的親和力[9]。從模型中還可看到，當(dāng)Leu置換了Trp后，氨基酸側(cè)鏈變短形成了一個空隙，可引起空間結(jié)構(gòu)的錯誤折疊。因此我們推測，Trp208Leu錯義突變可使α-螺旋發(fā)生異常折疊，引起γD結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)型改變，突變蛋白體穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致Fg易發(fā)生降解。另一方面，該突變也可能因空間構(gòu)型改變而影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的組裝和分泌缺陷，從而導(dǎo)致Fg量的減少。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，γTrp208Leu是本研究中兩個遺傳性低纖維蛋白原血癥家系的分子發(fā)病機(jī)制。Fg的基因突變研究不僅可闡明Fg結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，揭示纖維蛋白缺陷癥的分子機(jī)制，還有助于了解患者基因型和臨床表型的關(guān)系，為該類疾病的治療和預(yù)防出血提供實驗依據(jù)。

[1] Mosesson MW. Antithrombin I. Inhibition of thrombin gen

eration in plasma by fibrin formation[J]. Thromb Haemost, 2003, 89(1): 9-12.

[2] Frenkel E, Duksin C, Herman A, et al. Congenital hypofibrinogenemia in pregnancy: report of two cases and review of the literature[J]. Obstet Gynecol Surv, 2004, 59(11): 775-779.

[3] Moerloose P, Boehlen F, Neerman-Arbez M. Fibrinogen and the risk of thrombosis[J]. Semin Thromb Hemost, 2010, 36(1): 7-17.

[4] KoeninW. Fibrinogen in cardiovascular disease update[J]. Thromb Heamost, 2003, 89(4): 601-609.

[5] 姜林林, 王學(xué)鋒, 丁秋蘭, 等. 四例遺傳性異常纖維蛋白原血癥患者基因型和凝血功能分析[J]. 中華血液學(xué)雜志, 2012, 33(6): 475-479.

[6] Fujihara N, Haneishi A, Yamauchi K, et al. A C-terminal amino acid substitution in the γ-chain caused by a novel heterozygous frameshift mutation (Fibrinogen Matsumoto VII) results in hypofibrinogenaemia[J]. Thromb Haemost, 2010, 104(2): 213-223.

[7] Peyvandi F, Haertel S, Knaub S, et a1. Incidence of bleeding symptoms in 100 patients with inherited afibrinogenemia or hypofibrinogenemia[J]. Thromb Haemost, 2006, 4(7): 1634-1637.

[8] 江明華, 王曉歐, 舒曠怡, 等. 八個遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的臨床和基因突變分析[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志, 2014, 31(2): 134-139.

[9] Brennan SO, Davis RL, Conard K, et al. Novel fibrinogen mutation γ314Thr→Pro (fibrinogen AI duPont) associated with hepatic fibrinogen storage disease and hypofibrinogenaemia[J]. Liver International, 2010, 30(10): 1541-1547.

（本文編輯：胡苗苗）

Analysis of phenotype and genotype in two Chinese pedigrees with inherited hypofibrinogenemia causedby γTrp208Leu

YANG Lihong1, HAO Xiuping1, DING Hongxiang2, JIN Yanhui1, JIANG Minghua2, WANG Mingshan1. 1.Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Clinical Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To analyze the phenotype and genotype of two Chinese pedigrees with inherited hypofibrinogenemiaidentify by the same mutation. Methods: Laboratory tests, including prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), thrombin time (TT), plasminogen activity (PLG:C), and fibrinogen degradation products (FDPs) were detected in two pedigrees. The activity and antigen plasma fibrinogen (Fg:C, Fg:Ag) were analyzed by Clauss and immunoturbidimetry methods respectively. All the exons and exon-intron boundaries of the three Fg genes FGA, FGB and FGC were amplified by PCR and followed by direct sequencing. The mutation was analyzed by the Swiss-Model and PIC. Results: Two probands had normal PT, APTT, PLG:A and FDPs, but slightly prolonged TT. The Fg:C of the two probands were significantly reduced, 0.49 g/L and 0.63 g/L respectively. Their Fg:Ag were both significantly reduced, 0.63 g/L and 0.77 g/L respectively. These abnormalities were also found in his grandma and father of proband A, mother, aunt and cousin of proband B. Genetic analysis revealed a heterozygous G＞T change at nucleotide 5792 in exon 7 of FGG gene in the two probands, predicting a heterozygous Trp208Leu mutation. Model analysis showed that the Trp208Leu mutation is disrupted the native hydrogen bonding network of Thr314, and changed the molecular geometries, increasing instability of the protein. Conclusion: Inherited hypofibrinogenemia in those two pedigrees were caused by heterozygous Trp208Leu mutation in the γ chain of Fg.

inherited hypofibrinogenemia; fibrinogen; mutation; heterozygote; model analysis

R394

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.07.013

2014-12-10

溫州市科技計劃項目（H20110016）；浙江省科技廳科技計劃項目（2013C37046）。

楊麗紅（1974-），女，浙江寧海人，副主任技師，碩士。

王明山，主任技師，碩士生導(dǎo)師，Email：wywms@126.com。