周子曄，金輝，王陳翔，黃愛芳，王賢親，林觀樣

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 分析測(cè)試中心，浙江溫州 325035）

·論 著·

綠茶水提物對(duì)大鼠CYP450酶活力和mRNA表達(dá)的調(diào)控作用

周子曄1，金輝1，王陳翔1，黃愛芳1，王賢親2，林觀樣1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 分析測(cè)試中心，浙江溫州 325035）

目的：研究綠茶水提物對(duì)大鼠細(xì)胞色素P450（CYP450）酶活力和mRNA表達(dá)的影響。方法：SD大鼠隨機(jī)分組，連續(xù)灌胃綠茶水提物或水14 d后，同時(shí)給予探針?biāo)幏悄俏鞫?、安非他酮、甲苯磺丁脲和咪達(dá)唑侖，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（液質(zhì)聯(lián)用）測(cè)定給藥后不同時(shí)間點(diǎn)血藥濃度，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)而推測(cè)CYP1A2、CYP2B1、CYP2C11和CYP3A1酶活力。此外，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）技術(shù)測(cè)定CYP450的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組大鼠安非他酮與甲苯磺丁脲的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），推測(cè)綠茶水提物能誘導(dǎo)大鼠CYP2B1酶活力和抑制CYP2C11，而非那西丁與咪達(dá)唑侖參數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，綠茶水提物能顯著上調(diào)大鼠CYP2B1 mRNA水平并下調(diào)CYP2C11 mRNA水平，對(duì)CYP1A2與CYP3A1沒有影響。結(jié)論：持續(xù)攝取綠茶會(huì)改變CYP2B1與CYP2C11酶活力和mRNA表達(dá)水平，可能會(huì)引起藥物相互作用的發(fā)生。

綠茶水提物；CYP450；酶活力；mRNA表達(dá)；大鼠

細(xì)胞色素P450（CYP450）超基因家族是人體內(nèi)最重要的代謝酶系統(tǒng)，藥物相互作用通常是由于特定CYP450酶活力被其中一種合用藥物改變而引發(fā)，容易導(dǎo)致藥物治療失敗或者毒性反應(yīng)[1]。除了化學(xué)藥物外，許多植物類提取成分也能夠?qū)YP450酶活力進(jìn)行調(diào)節(jié)，近年來(lái)引起廣泛關(guān)注[2]?，F(xiàn)代流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，綠茶具有抗心血管疾病和防治癌癥的作用[3-5]，以及神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗高血壓等特性[6]。正是因?yàn)槠湓卺t(yī)療保健方面的療效，近十年來(lái)綠茶消費(fèi)量在世界范圍內(nèi)猛增。一部分人群將飲用綠茶視為日常生活中的食物補(bǔ)充，甚至作為某些疾病的輔助治療，因此會(huì)出現(xiàn)與藥物合用的情況。在本研究中，我們通過(guò)探針?biāo)幬锓ê蛯?shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）法考察綠茶水提物對(duì)大鼠CYP450酶活力和基因表達(dá)的調(diào)控作用，進(jìn)而推測(cè)其對(duì)藥物代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠，體質(zhì)量210～240 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（滬）-0005。

1.1.2 主要試劑：非那西?。ㄅ?hào)：STBB2177M9）和甲苯磺丁脲（批號(hào)：078K0725）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，純度均＞98%；安非他酮（批號(hào)：100671-201001）、咪達(dá)唑侖（批號(hào)：171250-200401）和卡馬西平（批號(hào)：100142-201105）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；咪達(dá)唑侖注射液（批號(hào)：20100108）購(gòu)自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純；RNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；Power SYBR Green PCR Master Mix試劑購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；龍井綠茶（批號(hào)：20120905）購(gòu)自杭州藝福堂茶業(yè)有限公司，綠茶稱質(zhì)量后研碎按料液比9∶100加入沸水，超聲提取15 min后過(guò)濾，濾渣重復(fù)加入沸水提取2次，合并3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮質(zhì)量濃度為0.09 g/mL。

1.1.3 主要儀器：Agilent 1200高效液相色譜儀；Bruker Esquire HCT質(zhì)譜儀；Beckman DU640核酸和蛋白分析儀；BIO-RAD MyCycler熱循環(huán)儀；Applied Biosystems 7500 RT-PCR儀。

1.2 Cocktail探針法測(cè)定綠茶水提物對(duì)大鼠CYP450酶活力的影響

1.2.1 動(dòng)物給藥與取樣：12只SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組每日灌胃給予綠茶水提物9 mL/kg（劑量相當(dāng)于60 kg成人每日飲用9 g綠茶茶湯），對(duì)照組灌胃給予等劑量水，連續(xù)灌胃14 d。于第15天分別灌胃給予非那西丁、安非他酮、咪達(dá)唑侖10 mg/kg及甲苯磺丁脲1 mg/kg，并于探針?biāo)幗o藥前0 h與給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24和36 h取大鼠尾靜脈血0.3 mL置于肝素化EP管中，8 000 r/min離心10 min，分離得100 μL血漿置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血漿樣品處理：將含有卡馬西平（100 ng/ mL）的乙腈溶液200 μL加入100 μL血漿樣品中沉淀血漿蛋白，渦旋1.0 min后15 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL于自動(dòng)進(jìn)樣器的樣品瓶中，設(shè)定5 μL進(jìn)樣檢測(cè)探針?biāo)幯帩舛取?/p>

1.2.3 檢測(cè)條件：Zorbax SB-C18色譜柱（150 mm ×2.1 mm，3.5 μm）；流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃；流動(dòng)相A（0.1%甲酸），B（乙腈），梯度洗脫：0～1.0 min（10%～10% B），1.0～4.0 min（10%～80% B），4.0～7.0 min（80%～80% B），7.0～9.0 min（80%～10% B），9.0～13.0 min（10%～10% B）。ESI（電噴霧離子源），干燥氣（N2）流速7 L/min、溫度350 ℃，霧化氣（N2）壓力25 psi、電壓3 500 V。采用選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式進(jìn)行定量，非那西丁、安非他酮、甲苯磺丁脲、咪達(dá)唑侖和卡馬西平的分子離子峰[M+H]+分別為m/z 180、240、271、326和237。非那西丁、甲苯磺丁脲在50～10 000 ng/mL血藥濃度范圍，安非他酮和咪達(dá)唑侖在10～2 000 ng/mL血藥濃度范圍，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行方法學(xué)考察。

1.3 RT-PCR法測(cè)定綠茶水提物對(duì)大鼠CYP450酶mRNA表達(dá)的影響

1.3.1 動(dòng)物給藥與取樣：8只SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組每日灌胃給予9 mL/kg綠茶水提物，對(duì)照組灌胃給予等劑量水，連續(xù)灌胃14 d。最后一次給藥后24 h處死，迅速取肝臟組織置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 總RNA提?。喊凑誖NA提取試劑盒說(shuō)明書提取大鼠肝臟總RNA，于260 nm和280 nm測(cè)定吸光度，兩者比值介于1.8和2.0之間視為合格，同時(shí)根據(jù)260 nm吸光值將RNA濃度調(diào)整至1μg/μL，用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.3 cDNA合成：取總RNA 1μg，分別加入random hexamer primer 1 μL，5×reaction buffer 4 μL，RiboLock RNase Inhibitor 1 μL，dNTP mix 2 μL，RebertAid M-MuLV Transcriptase 1μL和nucleasefree water 10 μL至終體積20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，最后70 ℃ 5 min終止反應(yīng)，得到的cDNA產(chǎn)物用于PCR反應(yīng)或于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 RT-PCR法測(cè)定mRNA表達(dá)水平：取上述cDNA產(chǎn)物2 μL，分別加入2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，20 mmol/L上下游引物各0.5 μL，nucleasefree water 7 μL，使反應(yīng)終體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。測(cè)定樣本CT值后，采用2-ΔΔCT法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組CYP450相對(duì)于對(duì)照組的基因表達(dá)倍數(shù)變化。大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2C11、CYP3A1和β-actin（內(nèi)參）引物序列見表1。

表1 大鼠CYP450酶引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)由DAS 2.0計(jì)算，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

如圖3所示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠CYP2B1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（4.85倍），CYP2C11 mRNA表達(dá)顯著下降（為對(duì)照組的20%），而CYP1A2與CYP3A1 2組間數(shù)據(jù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2 結(jié)果

2.1 綠茶水提物對(duì)大鼠CYP450酶活力的影響 如圖1所示，在已建立的探針?biāo)帣z測(cè)方法學(xué)中，非那西丁、安非他酮、甲苯磺丁脲、咪達(dá)唑侖與內(nèi)標(biāo)卡馬西平的保留時(shí)間分別為5.3、5.0、6.1、5.3和6.2 min，無(wú)雜質(zhì)干擾。血漿中4種探針?biāo)幾畹蜋z測(cè)限均為10 ng/mL，在線性范圍內(nèi)4種探針?biāo)幦諆?nèi)精密度RSD均小于7%，日間精密度RSD均小于9%，相對(duì)回收率均在97%～103%，絕對(duì)回收率均大于80%。本方法具有較高專屬性，適用于同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中4種探針?biāo)幍臐舛取?/p>

運(yùn)用建立的方法學(xué)對(duì)采集的血樣進(jìn)行血藥濃度測(cè)定，繪制平均藥時(shí)曲線圖和計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，如圖2與表2所示。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠連續(xù)給予綠茶水提物14 d后，安非他酮的Clz/F提高了53%，Vz/F增加了1.32倍，AUC（0-∞）減少了38%，Cmax降低了39%（P＜0.05），說(shuō)明綠茶水提物對(duì)CYP2B1酶活力具有顯著誘導(dǎo)作用。同時(shí)實(shí)驗(yàn)組甲苯磺丁脲的Clz/F降低了27%，AUC（0-∞）和Cmax分別為對(duì)照組的1.44倍和1.29倍（P＜0.05），說(shuō)明綠茶水提物對(duì)CYP2C11酶活力具有顯著抑制作用。而非那西丁和咪達(dá)唑侖藥時(shí)曲線圖和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均提示綠茶水提物對(duì)CYP1A2和CYP3A1酶活力無(wú)明顯影響。

2.2 綠茶水提物對(duì)大鼠CYP450 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

人CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4和大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2C11、CYP3A1氨基酸序列分別具有70%、74%、77%、73%同源性[7]，因此大鼠CYP450酶活力和mRNA水平變化對(duì)于人CYP450具有積極的參考意義。CYP450酶活力評(píng)估可以通過(guò)研究對(duì)應(yīng)底物的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)獲得[8-11]。我們運(yùn)用建立的cocktail探針法，通過(guò)探針?biāo)幏悄俏鞫?、安非他酮、甲苯磺丁脲和咪達(dá)唑侖的藥動(dòng)學(xué)改變來(lái)考察大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2C11、CYP3A1的酶活力變化。此外，RT-PCR法用于測(cè)定CYP450的mRNA表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)從酶活力和基因表達(dá)兩方面來(lái)推測(cè)綠茶水提物對(duì)CYP450的調(diào)控作用。

綠茶水提物在酶活力和mRNA水平對(duì)CYP2C11均具有顯著抑制作用，說(shuō)明酶活力的下降可能是由于mRNA表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而降低了CYP2C11的蛋白翻譯，間接導(dǎo)致了酶活力的下降。人體內(nèi)CYP2C9約占總CYP450含量的20%左右，負(fù)責(zé)約15%的臨床藥物的生物轉(zhuǎn)化，包括一些治療窗窄的藥物，如華法林、苯妥英鈉、格列苯脲和格列吡嗪等[12]。當(dāng)持續(xù)攝取綠茶期間，如有服用以上藥物可能會(huì)使其在體內(nèi)的代謝受到抑制，導(dǎo)致嚴(yán)重不良反應(yīng)，需要密切關(guān)注。

圖1 探針?biāo)幵诖笫笱獫{中的液質(zhì)檢測(cè)色譜圖

圖2 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組探針?biāo)幍钠骄帟r(shí)曲線圖（n=6）

表2 探針?biāo)幩巹?dòng)學(xué)參數(shù)（n=6，）

表2 探針?biāo)幩巹?dòng)學(xué)參數(shù)（n=6，）

注：AUC（0-∞）：曲線下面積；t1/2z：半衰期；CLz/F：清除率；Vz/F：表觀分布容積；Cmax：達(dá)峰濃度。與同探針?biāo)帉?duì)照組比：aP＜0.05

探針?biāo)?組別 AUC（0-∞）（h·ng-1·mL-1） t1/2z（h）CLz/F（L·h/kg） Vz/F（L/kg） Cmax（ng/mL）非那西丁對(duì)照組 17 988.756±2 823.2280.846±0.3710.566±0.073 0.694±0.32610 089.742±2140.69實(shí)驗(yàn)組 15 242.651±5 115.160.773±0.3390.711±0.202 0.76±0.30112 027.103±2971.627安非他酮對(duì)照組 2 007.898±673.9813.328±0.4855.396±1.57325.475±6.428 529.616±128.42實(shí)驗(yàn)組 1 243.71±229.27a4.854±1.4988.245±1.356a59.065±27.504a322.224±55.465a甲苯磺丁脲對(duì)照組 88 574.076±9 018.0435.289±0.6150.011±0.001 0.086±0.007 7 404.869±511.591實(shí)驗(yàn)組127 523.449±16 613.295a6.246±1.8760.008±0.001a0.071±0.018 9 531.455±1731.812a咪達(dá)唑侖對(duì)照組 2 740.648±1 158.3811.065±0.6214.232±1.758 5.485±1.442 1 526.608±677.481實(shí)驗(yàn)組 2 467.634±1 152.6241.119±0.2775.067±2.916 7.419±2.518 1 390.64±324.765

圖3 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠CYP450 mRNA表達(dá)水平

綠茶水提物對(duì)CYP2B1酶活力和mRNA表達(dá)均具有顯著誘導(dǎo)作用，說(shuō)明CYP2B1 mRNA表達(dá)上調(diào)間接促進(jìn)了酶活力的提高。CYP2B6參與約7%臨床上常用藥物的體內(nèi)代謝，如異丙酚、氯胺酮和哌替啶等麻醉藥物[13]，當(dāng)具有飲茶習(xí)慣的人群給予相關(guān)藥物時(shí)可能會(huì)加速其在體內(nèi)的代謝，引起藥效減弱，需引起關(guān)注。同時(shí)CYP2B6也是體內(nèi)重要的毒物代謝酶，通過(guò)催化毒物使其成為非活性的代謝產(chǎn)物，從而起到解毒作用[14]，綠茶水提物能誘導(dǎo)CYP2B6酶活力從而使外源性毒物加速代謝失活，減少體內(nèi)蓄積，降低毒性反應(yīng)對(duì)機(jī)體的傷害，這可能是其抗癌特性的重要機(jī)制之一，有待進(jìn)一步研究論證。

相對(duì)于化學(xué)藥物之間的相互作用，天然成分引起的藥物代謝改變較容易被忽視。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，天然成分的生物活性也能使CYP450酶活力發(fā)生改變，進(jìn)而影響特定酶的底物（藥物）在體內(nèi)的代謝過(guò)程，引起相互作用。本研究探討了綠茶水提物對(duì)體內(nèi)藥物代謝酶的調(diào)控作用，酶活性結(jié)果提示綠茶水提物對(duì)大鼠CYP2B1具有誘導(dǎo)作用，對(duì)CYP2C11具有抑制作用，而對(duì)CYP1A2與CYP3A1無(wú)影響。此外綠茶水提物對(duì)大鼠CYP450在酶活力和基因水平產(chǎn)生的誘導(dǎo)或抑制趨勢(shì)同步，說(shuō)明綠茶水提物對(duì)酶活力的影響可能是通過(guò)調(diào)控mRNA表達(dá)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。

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（本文編輯：吳昔昔）

Modulation of green tea extract on activities and mRNA expressions of cytochrome P450 enzymes in

rats

ZHOU Ziye1, JIN Hui1, WANG Chenxiang1, HUANG Aifang1, WANG Xianqin2, LIN Guanyang1. 1.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Testing and Analysis Center, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To investigate the potential effects of green tea extract on activities and mRNA expressions of cytochrome P450 (CYP450) enzymes in rats. Methods: After treatment with tea extract or water for 14 days, treatment group rats and control group rats were given the mixture of 4 probe substrates including phenacetin, bupropion, tolbutamide and midazolam. The plasma concentrations of probes at a series of time-points were determined with liquid chromatography tandom mass spectrometry. The activities of CYP450s were evaluated according to the pharmacokinetic parameters of corresponding substrates. Real-time PCR was applied to assess the mRNA expression levels of CYP450s. Results: The pharmacokinetic parameters of bupropion and tolbutamide from treatment group showed significant differences compared with control group, which indicated that green tea extract induced CYP2B1 activity and inhibited CYP2C11 activity. And no significant difference was found in pharmacokinetic parameters of phenacetin or midazolam from treatment group and control group. In addition, treatment with green tea extract significantly up-regulated the mRNA expression of CYP2B1 and downregulated the mRNA expression of CYP2C11, whereas it had no impact on CYP1A2 and CYP3A1. Conclusion: Continuous ingestion of green tea can modulate the activities and mRNA expressions of CYP2B1 and CYP2C11, which may lead to an undesired interaction.

green tea extract; CYP450; enzyme activity; mRNA expression; rats

R969.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.07.008

2014-11-07

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20110169）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院青年英才基金資助項(xiàng)目（qnyc010）。

周子曄（1981-），男，浙江溫州人，主管藥師，碩士。

林觀樣，主任藥師，Email：guanyanglinwzm@gmail. com。