肖芳蘭，呂攀攀，嚴錫娟，紀松軍，王伍，呂建新

（溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 生命科學學院，浙江省醫(yī)學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325035）

·論 著·

一種特異性檢測汞離子的大腸桿菌的構(gòu)建

肖芳蘭，呂攀攀，嚴錫娟，紀松軍，王伍，呂建新

（溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 生命科學學院，浙江省醫(yī)學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325035）

目的：利用增強型青色熒光蛋白（ECFP）作為報告物，構(gòu)建特異性檢測汞離子的微生物傳感器。方法：利用ecfp基因作為報告基因，構(gòu)建融合報告載體merR-OP-ecfp-T。然后將報告載體merR-OP-ecfp-T轉(zhuǎn)化至E.coli MC4100菌中完成傳感器的構(gòu)建，并對此微生物傳感器進行了測定條件的優(yōu)化及特異性、最適檢測范圍等相關(guān)參數(shù)的測定。結(jié)果：研究結(jié)果表明，此生物傳感器對汞離子特異性好，最適檢測汞離子濃度范圍為0.15～38.4 μmol/L。結(jié)論：成功地構(gòu)建了能夠特異性檢測汞離子的生物傳感器，為構(gòu)建汞離子等影響到人類健康、食品安全的化學物質(zhì)的超敏感生物傳感器奠定了基礎。

增強型青色熒光蛋白；汞離子；檢測；大腸桿菌

汞是唯一一種以氣態(tài)單質(zhì)形式存在于環(huán)境中并參與全球循環(huán)的重金屬元素。隨著經(jīng)濟發(fā)展，全球汞的產(chǎn)量和排放量逐漸增加。2007年我國汞排放量609 t，占到全球汞排放量的26%[1-2]。環(huán)境中的汞具有遷移性、持久性、高毒性和生物蓄積性。人們長期暴露于高汞環(huán)境以及高汞飲食容易導致汞中毒，輕者運動困難、手足失調(diào)，重者精神錯亂，甚至死亡；孕婦食用高汞食物易導致嬰兒先天弱智[2-4]。1953年發(fā)現(xiàn)的水俁病是典型的汞中毒病例[3，5-6]。

傳統(tǒng)的汞的檢測主要是原子吸收光譜法等理化方法，此類方法需要專業(yè)的儀器設備，操作復雜，樣品需要前處理，分析周期長，難以達到快速、方便等要求[7-8]。因此，研發(fā)一種簡便的汞離子檢測方法十分必要。20世紀70年代以來，微生物傳感器的出現(xiàn)為重金屬的檢測提供諸多便利[9]。生物法成為一種新型的汞離子檢測技術(shù)，尤其是細菌中汞的轉(zhuǎn)運機制研究越來越透徹[10-12]，mer操縱子調(diào)控機制及其基因功能的揭露[13-15]，使得汞離子微生物傳感器的研發(fā)成為研究熱點，其中如何利用模式生物提高汞離子檢測的特異性及敏感性備受關(guān)注。

熒光蛋白基因是一類常用的報告基因，自發(fā)現(xiàn)起不斷被改進并運用于生物學研究中[16]。本研究利用增強型青色熒光蛋白（enhanced cyan fluorescent protein，ECFP）作為報告物，ecfp取代mer操縱子下游基因，將merR、啟動子OP和ecfp基因進行基因融合，構(gòu)建一種特異性檢測汞離子的大腸桿菌，以期為除污減排提供新范例。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株：E.coli MC4100[F-，araD139，Δ（argF-lac），U169，rspL150，relA1，flbB5301，fruA25，deoC1，pstF25]，由本實驗室保存；E.coli DH5 α [F-，λ-，endA1，hsdR17，hsdM+，supE44，thi1，recA1，gyrA96，relA1，Δ（argF，lacZYA），U169，φ80d，Δ（lacZ），M15]，由本實驗室保存。

1.1.2 質(zhì)粒：pEASY-blunt-zero-cloning-T[Ampr，Kanar]，購于北京全式金生物有限公司。

pUC57，含有調(diào)節(jié)基因merR和啟動子，由金斯瑞生物科技有限公司合成。Hg調(diào)節(jié)基因merR和啟動子氨基酸序列信息來自于粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens的pDU1358[17]（GenBank Accession No：M24940.1[18]），再由金斯瑞公司按照大腸桿菌偏好使用的密碼子進行優(yōu)化獲得。

pECFP，含有ecfp，由本實驗室保存。

1.1.3 引物：擴增merR-OP的正反向引物分別為P1（merR-F）：CATCCGCCAAAACAGCCAAGCTGGAGACCGT TTAAACTCAAACAGCATCGGCACCACGC和P2（merR-R）：CCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATACGCTTGTC CTTTCAAATCTGGATTG；擴增ecfp的正反向引物分別為P3（ecfp-F）：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG和P4（ecfp-R）：GAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC。

1.2 方法

1.2.1 報告菌株merR-OP-ecfp-T/MC4100的構(gòu)建：利用P1（merR-F）和P2（merR-R）擴增調(diào)節(jié)基因和啟動子merR-OP，P3（ecfp-F）和P4（ecfp-R）擴增ecfp，PCR反應體系為：2×phanta Taq 25 μL，正反引物各0.5 μL，模板1 μL，用ddH2O補齊到50 μL。PCR反應條件為：94 ℃、3 min；94 ℃、40 s，55 ℃、40 s，72 ℃、1 min，35個循環(huán)；72 ℃、10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定并膠回收試劑盒進行膠回收。

merR-OP、ecfp膠回收片段merR和ecfp分別測濃度，按照公式C1V1/bp1=C2V2/bp2，計算merR（1）和ecfp（2）加入的體積。因為設計引物時，meR-OP的反向引物P2（merR-R）含有ecfp的N端的同源臂單片段的同源臂序列，所以擴增的單片段merR-OP下游含有ecfp上游同源臂序列，可通過不加引物PCR反應8個循環(huán)，將3個基因片段連接起來，交叉PCR反應體系為：2×phanta Taq 15 μL，模板merR和ecfp分別為1.4 μL和2 μL，用ddH2O補齊到30 μL。反應條件為：94 ℃、3 min；94 ℃、40 s，55 ℃、40 s，72 ℃、1 min，8個循環(huán)；72 ℃、10 min，4 ℃保存。

再以上述30 μL PCR產(chǎn)物為模板，加入正反引物各0.5 μL和2×phanta Taq 5 μL，用ddH2O補齊到總體積為40 μL。PCR反應條件與擴增各元件單片段條件相同。產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定并膠回收試劑盒進行膠回收。

膠回收的融合基因片段merR-OP-ecfp與pEASY-blunt-zero-cloning-T載體連接后，轉(zhuǎn)化到超級感受菌株E.coli DH5α后挑取陽性克隆鑒定并測序，測序正確的克隆擴大培養(yǎng)后提質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化至野生型菌E.coli MC4100。

1.2.2 汞離子誘導報告菌株的時間依賴性實驗：取含報告載體的宿主菌MC4100過夜菌以1∶50接到新鮮的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，250 r/min，擴大培養(yǎng)至OD600值為0.6左右（OD600值為0.6左右大腸桿菌處于對數(shù)生長期），加入汞離子溶液使終濃度為1.0×10-5mol/L，3個平行錐形瓶。將以上菌液于37 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)，分別在0、1、2、3、4、5、6、7 h以及overnight（20 h）時間點收集菌液1 mL，4 000 r/min離心，棄上清。用脫鹽緩沖液（desalting buffer，DB）稀釋20倍后（根據(jù)菌液濃度稀釋不同倍數(shù)，使得稀釋后OD600值相差不大），分別測量其稀釋液熒光值與OD600值。

1.2.3 汞離子誘導報告菌株的濃度依賴性實驗：取含報告載體的宿主菌MC4100過夜菌以1∶50接到新鮮的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，250 r/min，擴大培養(yǎng)至OD600值為0.6左右，分裝至試管，每管0.99 mL，加入等體積（10 μL）不同濃度的汞離子溶液至各管菌液終濃度分別為0、1.0×10-9、1.0×10-8、1.0× 10-7、1.0×10-6、1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-3mol/L，各做3個平行管。將以上菌液于37 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)7 h后進行樣品前處理，處理方法同

1.2.2，再分別測量其稀釋液熒光值與OD600值。

1.2.4 傳感器對汞離子的特異性實驗：取含報告載體的宿主菌MC4100過夜菌以1∶50接到新鮮的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，250 r/min，擴大培養(yǎng)至OD600值為0.6左右，分裝至試管，每管0.98 mL，分別加入20 μL不同金屬離子（Mg2+、Zn2+、Fe2+、Pb2+、Mn2+、Ca2+、Co2+、Ni2+、Hg2+、Cu2+、Cd2+）使其終濃度為20 μmol/L，另加等體積無菌MilliQ H2O作為陰性對照，各做3個平行管。將以上菌液于37 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)7 h后（Pb2+離子為避光孵育），進行樣品前處理，處理方法同1.2.2，再分別測量其稀釋液熒光值與OD600值。

1.2.5 確定傳感器檢測汞離子的線性范圍：取含報告載體的宿主菌MC4100過夜菌以1∶50接到新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃，250 r/min，擴大培養(yǎng)至OD600值為0.6左右，分裝至試管，每管0.9 mL，加入100 μL不同濃度的汞離子溶液至各管菌液終濃度分別為0、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2、38.4 μmol/L，各做3個平行管。將以上菌液于37 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)7 h后，進行樣品前處理，進行樣品前處理，處理方法同1.2.2，分別測量其稀釋液熒光值與OD600值。

2 結(jié)果

2.1 融合基因、報告載體以及報告菌株的構(gòu)建 首先擴增汞檢測元件中的merR-OP和ecfp，再利用交叉PCR將兩單片段進行基因融合，成功構(gòu)建汞離子檢測元件后，將其與pEASY-blunt-zero-cloning-T載體連接，轉(zhuǎn)化到超級感受態(tài)E.coli DH5α中，挑取陽性克隆鑒定且測序鑒定正確，提取質(zhì)粒merROP-ecfp-T，轉(zhuǎn)化至E.coli MC4100感受態(tài)中，從而成功構(gòu)建汞離子融合檢測元件的報告菌株。結(jié)果見圖1。

圖1 報告菌株構(gòu)建過程電泳圖

2.2 報告菌株對汞離子的時間依賴性實驗 蛋白表達和成熟需要經(jīng)過一系列的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及后翻譯調(diào)控過程，所以不同的蛋白成熟時間不同。用10 μmol汞離子溶液誘導此生物傳感器，在不用時間點的測定ECFP表達量，結(jié)果表明，在0～7 h內(nèi)，隨著誘導時間的延長，ECFP表達量逐漸增強，但是在過夜后，由于營養(yǎng)供應不足，生長條件有限，ECFP

表達量下降。所以選用7 h作為誘導時間。見圖2。

圖2 汞離子誘導報告菌株的時間依賴性實驗

2.3 汞離子誘導報告菌株的濃度依賴性實驗 ECFP的表達量不僅與細菌培養(yǎng)時間有關(guān)，還與汞離子濃度相關(guān)。當環(huán)境中不存在汞離子時，merR表達的調(diào)節(jié)蛋白與啟動子結(jié)合，阻礙啟動子轉(zhuǎn)錄激活，當存在汞離子時，它與merR特異性結(jié)合，啟動子激活ECFP表達。當汞離子濃度不同時，ECFP表達量不同。見圖3。

圖3 報告菌株對汞離子的濃度依賴實驗

用不同濃度汞離子誘導此生物傳感器7 h，結(jié)果表明，當汞離子在10-8～10-5mol/L濃度范圍內(nèi)，ECFP表達量隨著汞離子濃度升高而增加，當濃度大于10-5mol/L，熒光表達量下降。降低的原因是由于高濃度汞離子抑制E.coli MC4100生長，細菌濃度低，使得ECFP表達量少。因此，ECFP的表達不僅與時間有關(guān)，也與加入的汞離子濃度有關(guān)。

2.4 報告菌株對汞離子的特異性實驗 構(gòu)建此傳感器的汞離子檢測元件中啟動子來源于粘質(zhì)沙雷氏菌的pDU1358[17]，為驗證其啟動子是否特異，加入不同的金屬離子誘導該報告菌株，結(jié)果表明，只有汞離子誘導此傳感器能夠產(chǎn)生熒光，其他金屬都無法誘導熒光產(chǎn)生，此傳感器特異性好。見圖4。

圖4 報告菌株的特異性實驗

2.5 報告菌株檢測汞離子的線性范圍 根據(jù)汞離子誘導報告菌株的濃度依賴性實驗結(jié)果（見圖3），在10-8～10-5mol/L濃度范圍內(nèi)存在某一良好線性關(guān)系，且可能在10-5～10-4mol/L存在某一濃度使得熒光強度最強。加入不同濃度的汞離子誘導此傳感器誘導7 h，通過摸索得出此傳感器的檢測汞離子的線性范圍為0.15～38.4 μmol/L，最低檢測限為0.15 μmol/L，最高檢測限為38.4 μmol/L，且在此范圍內(nèi)符合一元二次方程y=alog（x）+b，且相關(guān)系數(shù)R接近1。見圖5。

圖5 報告菌株檢測汞離子的線性范圍

3 討論

傳統(tǒng)的重金屬檢測方法如ICP-MS、冷原子吸收法等，需要專業(yè)設備，成本高，且操作比較繁瑣，本研究構(gòu)建的報告菌株通過熒光強度可直觀地反映水體環(huán)境中汞離子濃度，操作簡便，熒光強度高且穩(wěn)定。

本研究對此傳感器檢測條件進行了初步的探索，優(yōu)化了報告菌株的汞離子的起始孵育濁度以及誘導時間對熒光強度的比較。此報告菌株在7 h ECFP表達量較高，當細菌起始孵育濁度在OD600值為0.4～0.6時，經(jīng)測其線性范圍，相關(guān)系數(shù)R接近1，汞誘導報告菌株呈現(xiàn)較好的線性。

本研究構(gòu)建的傳感器的報告物ECFP在7 h能達到較強熒光，He等[19]構(gòu)建的汞傳感器報告物為增強型綠色熒光蛋白（EGFP），經(jīng)15 h有較強表達，相對而言本研究使用的ECFP成熟時間短，因此報告菌株具有快速檢測的優(yōu)點。本研究通過篩選特異性啟動子，啟動子源于Serratia marcescens，特異性專一，其他重金屬無法誘導該菌株產(chǎn)生熒光，而Gireesh-Babu等[20]和Tao等[21]構(gòu)建的重金屬微生物傳感器不能專一檢測某一種金屬離子，在實際應用中無法對特定金屬離子進行精確的定量檢測。本實驗構(gòu)建的微生物傳感器的線性檢測范圍為0.15～38.4 μmol/L，最低檢測限為0.15 μmol/L，國家規(guī)定廢水環(huán)境中的汞排放標準＜0.05 mg/L（即0.25 μmol/L），此微生物傳感器能夠達到該檢測標準。He等[19]構(gòu)建的汞傳感器最低檢測限為0.2 μmol/L，相比較于本研究構(gòu)建的傳感器檢測限更低。此微生物傳感器最高檢測限為38.4 μmol/L，而Priyadarshi等[17]構(gòu)建的汞離子傳感器最高檢測限為1.7 μmol/ L，本傳感器在檢測重度汞污染環(huán)境具有較大優(yōu)勢。

本研究構(gòu)建的檢測汞離子微生物傳感器，能夠?qū)Ｒ弧㈧`敏地檢測水環(huán)境中汞離子濃度，希望通過進一步的條件優(yōu)化以及加工，比如固定化探針，從而成為能夠檢測土壤、蔬菜、食品中汞離子的含量，達到對各種環(huán)境中汞離子實時監(jiān)測的效果，并為構(gòu)建其他重金屬離子生物傳感器奠定基礎。

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（本文編輯：吳健敏）

The establishment of a specific E.coli for detection of mercury (II) ions

XIAO Fanglan, LV Panpan, YANXijuan, JI Songjun, WANG Wu, LV Jianxin. Zhejiang Key Laboratory of Medical Genetics, School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To construct a specific biosensor to detect mercury ions using the enhanced cyan fluorescent protein as a reporter. Methods: The fusion reporter vector, merR-OP-ecfp-T, was constructed using ecfp as reporter gene. Then the reporter vector merR-OP-ecfp-T was transformed into Escherichia coli MC4100 wide type strain. The growth conditions optimization of this completed biosensor and its specificity and the optimum detection range parameters were determined. Results: The results showed that the mercury biosensor had a good specificity, the optimal detection range of mercury concentration was 0.15-38.4 μmol/L. A specific biosensor were successfully constructed to detect mercury ions. Conlusion: The work provides the foundation for developing other hypersensitive biosensors for the chemicals such as explosives, polycyclic aromatic hydrocarbons, polychlorinated hydrocarbons and heavy metals that are important to national security, human health, environment, energy supply and food safety.

enhanced cyan fluorescent protein; mercury ion; detection; E.coli

R12

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.07.002

2015-03-23

國家高科技研究發(fā)展計劃（863計劃）（2014AA06A 514）。

肖芳蘭（1989-），女，江西宜春人，碩士生。

呂建新，教授，博士生導師，Email：jxlv313@163. com。