肖芳蘭，呂攀攀，嚴(yán)錫娟，紀(jì)松軍，王伍，呂建新

（溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035）

·論 著·

一種特異性檢測(cè)汞離子的大腸桿菌的構(gòu)建

肖芳蘭，呂攀攀，嚴(yán)錫娟，紀(jì)松軍，王伍，呂建新

（溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035）

目的：利用增強(qiáng)型青色熒光蛋白（ECFP）作為報(bào)告物，構(gòu)建特異性檢測(cè)汞離子的微生物傳感器。方法：利用ecfp基因作為報(bào)告基因，構(gòu)建融合報(bào)告載體merR-OP-ecfp-T。然后將報(bào)告載體merR-OP-ecfp-T轉(zhuǎn)化至E.coli MC4100菌中完成傳感器的構(gòu)建，并對(duì)此微生物傳感器進(jìn)行了測(cè)定條件的優(yōu)化及特異性、最適檢測(cè)范圍等相關(guān)參數(shù)的測(cè)定。結(jié)果：研究結(jié)果表明，此生物傳感器對(duì)汞離子特異性好，最適檢測(cè)汞離子濃度范圍為0.15～38.4 μmol/L。結(jié)論：成功地構(gòu)建了能夠特異性檢測(cè)汞離子的生物傳感器，為構(gòu)建汞離子等影響到人類健康、食品安全的化學(xué)物質(zhì)的超敏感生物傳感器奠定了基礎(chǔ)。

增強(qiáng)型青色熒光蛋白；汞離子；檢測(cè)；大腸桿菌

汞是唯一一種以氣態(tài)單質(zhì)形式存在于環(huán)境中并參與全球循環(huán)的重金屬元素。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，全球汞的產(chǎn)量和排放量逐漸增加。2007年我國(guó)汞排放量609 t，占到全球汞排放量的26%[1-2]。環(huán)境中的汞具有遷移性、持久性、高毒性和生物蓄積性。人們長(zhǎng)期暴露于高汞環(huán)境以及高汞飲食容易導(dǎo)致汞中毒，輕者運(yùn)動(dòng)困難、手足失調(diào)，重者精神錯(cuò)亂，甚至死亡；孕婦食用高汞食物易導(dǎo)致嬰兒先天弱智[2-4]。1953年發(fā)現(xiàn)的水俁病是典型的汞中毒病例[3，5-6]。

傳統(tǒng)的汞的檢測(cè)主要是原子吸收光譜法等理化方法，此類方法需要專業(yè)的儀器設(shè)備，操作復(fù)雜，樣品需要前處理，分析周期長(zhǎng)，難以達(dá)到快速、方便等要求[7-8]。因此，研發(fā)一種簡(jiǎn)便的汞離子檢測(cè)方法十分必要。20世紀(jì)70年代以來(lái)，微生物傳感器的出現(xiàn)為重金屬的檢測(cè)提供諸多便利[9]。生物法成為一種新型的汞離子檢測(cè)技術(shù)，尤其是細(xì)菌中汞的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究越來(lái)越透徹[10-12]，mer操縱子調(diào)控機(jī)制及其基因功能的揭露[13-15]，使得汞離子微生物傳感器的研發(fā)成為研究熱點(diǎn)，其中如何利用模式生物提高汞離子檢測(cè)的特異性及敏感性備受關(guān)注。

熒光蛋白基因是一類常用的報(bào)告基因，自發(fā)現(xiàn)起不斷被改進(jìn)并運(yùn)用于生物學(xué)研究中[16]。本研究利用增強(qiáng)型青色熒光蛋白（enhanced cyan fluorescent protein，ECFP）作為報(bào)告物，ecfp取代mer操縱子下游基因，將merR、啟動(dòng)子OP和ecfp基因進(jìn)行基因融合，構(gòu)建一種特異性檢測(cè)汞離子的大腸桿菌，以期為除污減排提供新范例。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株：E.coli MC4100[F-，araD139，Δ（argF-lac），U169，rspL150，relA1，flbB5301，fruA25，deoC1，pstF25]，由本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coli DH5 α [F-，λ-，endA1，hsdR17，hsdM+，supE44，thi1，recA1，gyrA96，relA1，Δ（argF，lacZYA），U169，φ80d，Δ（lacZ），M15]，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 質(zhì)粒：pEASY-blunt-zero-cloning-T[Ampr，Kanar]，購(gòu)于北京全式金生物有限公司。

pUC57，含有調(diào)節(jié)基因merR和啟動(dòng)子，由金斯瑞生物科技有限公司合成。Hg調(diào)節(jié)基因merR和啟動(dòng)子氨基酸序列信息來(lái)自于粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens的pDU1358[17]（GenBank Accession No：M24940.1[18]），再由金斯瑞公司按照大腸桿菌偏好使用的密碼子進(jìn)行優(yōu)化獲得。

pECFP，含有ecfp，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 引物：擴(kuò)增merR-OP的正反向引物分別為P1（merR-F）：CATCCGCCAAAACAGCCAAGCTGGAGACCGT TTAAACTCAAACAGCATCGGCACCACGC和P2（merR-R）：CCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATACGCTTGTC CTTTCAAATCTGGATTG；擴(kuò)增ecfp的正反向引物分別為P3（ecfp-F）：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG和P4（ecfp-R）：GAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC。

1.2 方法

1.2.1 報(bào)告菌株merR-OP-ecfp-T/MC4100的構(gòu)建：利用P1（merR-F）和P2（merR-R）擴(kuò)增調(diào)節(jié)基因和啟動(dòng)子merR-OP，P3（ecfp-F）和P4（ecfp-R）擴(kuò)增ecfp，PCR反應(yīng)體系為：2×phanta Taq 25 μL，正反引物各0.5 μL，模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)齊到50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃、3 min；94 ℃、40 s，55 ℃、40 s，72 ℃、1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定并膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。

merR-OP、ecfp膠回收片段merR和ecfp分別測(cè)濃度，按照公式C1V1/bp1=C2V2/bp2，計(jì)算merR（1）和ecfp（2）加入的體積。因?yàn)樵O(shè)計(jì)引物時(shí)，meR-OP的反向引物P2（merR-R）含有ecfp的N端的同源臂單片段的同源臂序列，所以擴(kuò)增的單片段merR-OP下游含有ecfp上游同源臂序列，可通過(guò)不加引物PCR反應(yīng)8個(gè)循環(huán)，將3個(gè)基因片段連接起來(lái)，交叉PCR反應(yīng)體系為：2×phanta Taq 15 μL，模板merR和ecfp分別為1.4 μL和2 μL，用ddH2O補(bǔ)齊到30 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃、3 min；94 ℃、40 s，55 ℃、40 s，72 ℃、1 min，8個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min，4 ℃保存。

再以上述30 μL PCR產(chǎn)物為模板，加入正反引物各0.5 μL和2×phanta Taq 5 μL，用ddH2O補(bǔ)齊到總體積為40 μL。PCR反應(yīng)條件與擴(kuò)增各元件單片段條件相同。產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定并膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。

膠回收的融合基因片段merR-OP-ecfp與pEASY-blunt-zero-cloning-T載體連接后，轉(zhuǎn)化到超級(jí)感受菌株E.coli DH5α后挑取陽(yáng)性克隆鑒定并測(cè)序，測(cè)序正確的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化至野生型菌E.coli MC4100。

1.2.2 汞離子誘導(dǎo)報(bào)告菌株的時(shí)間依賴性實(shí)驗(yàn)：取含報(bào)告載體的宿主菌MC4100過(guò)夜菌以1∶50接到新鮮的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，250 r/min，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600值為0.6左右（OD600值為0.6左右大腸桿菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期），加入汞離子溶液使終濃度為1.0×10-5mol/L，3個(gè)平行錐形瓶。將以上菌液于37 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)，分別在0、1、2、3、4、5、6、7 h以及overnight（20 h）時(shí)間點(diǎn)收集菌液1 mL，4 000 r/min離心，棄上清。用脫鹽緩沖液（desalting buffer，DB）稀釋20倍后（根據(jù)菌液濃度稀釋不同倍數(shù)，使得稀釋后OD600值相差不大），分別測(cè)量其稀釋液熒光值與OD600值。

1.2.3 汞離子誘導(dǎo)報(bào)告菌株的濃度依賴性實(shí)驗(yàn)：取含報(bào)告載體的宿主菌MC4100過(guò)夜菌以1∶50接到新鮮的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，250 r/min，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600值為0.6左右，分裝至試管，每管0.99 mL，加入等體積（10 μL）不同濃度的汞離子溶液至各管菌液終濃度分別為0、1.0×10-9、1.0×10-8、1.0× 10-7、1.0×10-6、1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-3mol/L，各做3個(gè)平行管。將以上菌液于37 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)7 h后進(jìn)行樣品前處理，處理方法同

1.2.2，再分別測(cè)量其稀釋液熒光值與OD600值。

1.2.4 傳感器對(duì)汞離子的特異性實(shí)驗(yàn)：取含報(bào)告載體的宿主菌MC4100過(guò)夜菌以1∶50接到新鮮的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，250 r/min，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600值為0.6左右，分裝至試管，每管0.98 mL，分別加入20 μL不同金屬離子（Mg2+、Zn2+、Fe2+、Pb2+、Mn2+、Ca2+、Co2+、Ni2+、Hg2+、Cu2+、Cd2+）使其終濃度為20 μmol/L，另加等體積無(wú)菌MilliQ H2O作為陰性對(duì)照，各做3個(gè)平行管。將以上菌液于37 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)7 h后（Pb2+離子為避光孵育），進(jìn)行樣品前處理，處理方法同1.2.2，再分別測(cè)量其稀釋液熒光值與OD600值。

1.2.5 確定傳感器檢測(cè)汞離子的線性范圍：取含報(bào)告載體的宿主菌MC4100過(guò)夜菌以1∶50接到新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃，250 r/min，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600值為0.6左右，分裝至試管，每管0.9 mL，加入100 μL不同濃度的汞離子溶液至各管菌液終濃度分別為0、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2、38.4 μmol/L，各做3個(gè)平行管。將以上菌液于37 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)7 h后，進(jìn)行樣品前處理，進(jìn)行樣品前處理，處理方法同1.2.2，分別測(cè)量其稀釋液熒光值與OD600值。

2 結(jié)果

2.1 融合基因、報(bào)告載體以及報(bào)告菌株的構(gòu)建 首先擴(kuò)增汞檢測(cè)元件中的merR-OP和ecfp，再利用交叉PCR將兩單片段進(jìn)行基因融合，成功構(gòu)建汞離子檢測(cè)元件后，將其與pEASY-blunt-zero-cloning-T載體連接，轉(zhuǎn)化到超級(jí)感受態(tài)E.coli DH5α中，挑取陽(yáng)性克隆鑒定且測(cè)序鑒定正確，提取質(zhì)粒merROP-ecfp-T，轉(zhuǎn)化至E.coli MC4100感受態(tài)中，從而成功構(gòu)建汞離子融合檢測(cè)元件的報(bào)告菌株。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 報(bào)告菌株構(gòu)建過(guò)程電泳圖

2.2 報(bào)告菌株對(duì)汞離子的時(shí)間依賴性實(shí)驗(yàn) 蛋白表達(dá)和成熟需要經(jīng)過(guò)一系列的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及后翻譯調(diào)控過(guò)程，所以不同的蛋白成熟時(shí)間不同。用10 μmol汞離子溶液誘導(dǎo)此生物傳感器，在不用時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定ECFP表達(dá)量，結(jié)果表明，在0～7 h內(nèi)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，ECFP表達(dá)量逐漸增強(qiáng)，但是在過(guò)夜后，由于營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，生長(zhǎng)條件有限，ECFP

表達(dá)量下降。所以選用7 h作為誘導(dǎo)時(shí)間。見(jiàn)圖2。

圖2 汞離子誘導(dǎo)報(bào)告菌株的時(shí)間依賴性實(shí)驗(yàn)

2.3 汞離子誘導(dǎo)報(bào)告菌株的濃度依賴性實(shí)驗(yàn) ECFP的表達(dá)量不僅與細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)，還與汞離子濃度相關(guān)。當(dāng)環(huán)境中不存在汞離子時(shí)，merR表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白與啟動(dòng)子結(jié)合，阻礙啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄激活，當(dāng)存在汞離子時(shí)，它與merR特異性結(jié)合，啟動(dòng)子激活ECFP表達(dá)。當(dāng)汞離子濃度不同時(shí)，ECFP表達(dá)量不同。見(jiàn)圖3。

圖3 報(bào)告菌株對(duì)汞離子的濃度依賴實(shí)驗(yàn)

用不同濃度汞離子誘導(dǎo)此生物傳感器7 h，結(jié)果表明，當(dāng)汞離子在10-8～10-5mol/L濃度范圍內(nèi)，ECFP表達(dá)量隨著汞離子濃度升高而增加，當(dāng)濃度大于10-5mol/L，熒光表達(dá)量下降。降低的原因是由于高濃度汞離子抑制E.coli MC4100生長(zhǎng)，細(xì)菌濃度低，使得ECFP表達(dá)量少。因此，ECFP的表達(dá)不僅與時(shí)間有關(guān)，也與加入的汞離子濃度有關(guān)。

2.4 報(bào)告菌株對(duì)汞離子的特異性實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建此傳感器的汞離子檢測(cè)元件中啟動(dòng)子來(lái)源于粘質(zhì)沙雷氏菌的pDU1358[17]，為驗(yàn)證其啟動(dòng)子是否特異，加入不同的金屬離子誘導(dǎo)該報(bào)告菌株，結(jié)果表明，只有汞離子誘導(dǎo)此傳感器能夠產(chǎn)生熒光，其他金屬都無(wú)法誘導(dǎo)熒光產(chǎn)生，此傳感器特異性好。見(jiàn)圖4。

圖4 報(bào)告菌株的特異性實(shí)驗(yàn)

2.5 報(bào)告菌株檢測(cè)汞離子的線性范圍 根據(jù)汞離子誘導(dǎo)報(bào)告菌株的濃度依賴性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖3），在10-8～10-5mol/L濃度范圍內(nèi)存在某一良好線性關(guān)系，且可能在10-5～10-4mol/L存在某一濃度使得熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。加入不同濃度的汞離子誘導(dǎo)此傳感器誘導(dǎo)7 h，通過(guò)摸索得出此傳感器的檢測(cè)汞離子的線性范圍為0.15～38.4 μmol/L，最低檢測(cè)限為0.15 μmol/L，最高檢測(cè)限為38.4 μmol/L，且在此范圍內(nèi)符合一元二次方程y=alog（x）+b，且相關(guān)系數(shù)R接近1。見(jiàn)圖5。

圖5 報(bào)告菌株檢測(cè)汞離子的線性范圍

3 討論

傳統(tǒng)的重金屬檢測(cè)方法如ICP-MS、冷原子吸收法等，需要專業(yè)設(shè)備，成本高，且操作比較繁瑣，本研究構(gòu)建的報(bào)告菌株通過(guò)熒光強(qiáng)度可直觀地反映水體環(huán)境中汞離子濃度，操作簡(jiǎn)便，熒光強(qiáng)度高且穩(wěn)定。

本研究對(duì)此傳感器檢測(cè)條件進(jìn)行了初步的探索，優(yōu)化了報(bào)告菌株的汞離子的起始孵育濁度以及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的比較。此報(bào)告菌株在7 h ECFP表達(dá)量較高，當(dāng)細(xì)菌起始孵育濁度在OD600值為0.4～0.6時(shí)，經(jīng)測(cè)其線性范圍，相關(guān)系數(shù)R接近1，汞誘導(dǎo)報(bào)告菌株呈現(xiàn)較好的線性。

本研究構(gòu)建的傳感器的報(bào)告物ECFP在7 h能達(dá)到較強(qiáng)熒光，He等[19]構(gòu)建的汞傳感器報(bào)告物為增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP），經(jīng)15 h有較強(qiáng)表達(dá)，相對(duì)而言本研究使用的ECFP成熟時(shí)間短，因此報(bào)告菌株具有快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。本研究通過(guò)篩選特異性啟動(dòng)子，啟動(dòng)子源于Serratia marcescens，特異性專一，其他重金屬無(wú)法誘導(dǎo)該菌株產(chǎn)生熒光，而Gireesh-Babu等[20]和Tao等[21]構(gòu)建的重金屬微生物傳感器不能專一檢測(cè)某一種金屬離子，在實(shí)際應(yīng)用中無(wú)法對(duì)特定金屬離子進(jìn)行精確的定量檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的微生物傳感器的線性檢測(cè)范圍為0.15～38.4 μmol/L，最低檢測(cè)限為0.15 μmol/L，國(guó)家規(guī)定廢水環(huán)境中的汞排放標(biāo)準(zhǔn)＜0.05 mg/L（即0.25 μmol/L），此微生物傳感器能夠達(dá)到該檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。He等[19]構(gòu)建的汞傳感器最低檢測(cè)限為0.2 μmol/L，相比較于本研究構(gòu)建的傳感器檢測(cè)限更低。此微生物傳感器最高檢測(cè)限為38.4 μmol/L，而Priyadarshi等[17]構(gòu)建的汞離子傳感器最高檢測(cè)限為1.7 μmol/ L，本傳感器在檢測(cè)重度汞污染環(huán)境具有較大優(yōu)勢(shì)。

本研究構(gòu)建的檢測(cè)汞離子微生物傳感器，能夠?qū)Ｒ弧㈧`敏地檢測(cè)水環(huán)境中汞離子濃度，希望通過(guò)進(jìn)一步的條件優(yōu)化以及加工，比如固定化探針，從而成為能夠檢測(cè)土壤、蔬菜、食品中汞離子的含量，達(dá)到對(duì)各種環(huán)境中汞離子實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的效果，并為構(gòu)建其他重金屬離子生物傳感器奠定基礎(chǔ)。

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（本文編輯：吳健敏）

The establishment of a specific E.coli for detection of mercury (II) ions

XIAO Fanglan, LV Panpan, YANXijuan, JI Songjun, WANG Wu, LV Jianxin. Zhejiang Key Laboratory of Medical Genetics, School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To construct a specific biosensor to detect mercury ions using the enhanced cyan fluorescent protein as a reporter. Methods: The fusion reporter vector, merR-OP-ecfp-T, was constructed using ecfp as reporter gene. Then the reporter vector merR-OP-ecfp-T was transformed into Escherichia coli MC4100 wide type strain. The growth conditions optimization of this completed biosensor and its specificity and the optimum detection range parameters were determined. Results: The results showed that the mercury biosensor had a good specificity, the optimal detection range of mercury concentration was 0.15-38.4 μmol/L. A specific biosensor were successfully constructed to detect mercury ions. Conlusion: The work provides the foundation for developing other hypersensitive biosensors for the chemicals such as explosives, polycyclic aromatic hydrocarbons, polychlorinated hydrocarbons and heavy metals that are important to national security, human health, environment, energy supply and food safety.

enhanced cyan fluorescent protein; mercury ion; detection; E.coli

R12

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.07.002

2015-03-23

國(guó)家高科技研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2014AA06A 514）。

肖芳蘭（1989-），女，江西宜春人，碩士生。

呂建新，教授，博士生導(dǎo)師，Email：jxlv313@163. com。