王志翊，汪春龍，王賢親，陳進(jìn)，孫來芳，馬建設(shè)

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué) 分析測試中心，浙江 溫州 325035）

·論 著·

兔急性滅多威中毒毒代動力學(xué)觀察

王志翊1，汪春龍2，王賢親3，陳進(jìn)1，孫來芳1，馬建設(shè)2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué) 分析測試中心，浙江 溫州 325035）

目的：觀察兔急性滅多威中毒的毒代動力學(xué)，探討其對組織器官的損害作用。方法：一次性予滅多威劑量12 mg/kg灌胃染毒，觀察其不同時間點(diǎn)的癥狀與體征；采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)檢測兔血漿中滅多威吸收、代謝過程，并繪制濃度-時間曲線；用DAS 2.0軟件分析并計算毒代動力學(xué)參數(shù)；熒光倒置顯微鏡觀察兔腦、心、肝、腎臟器病理學(xué)改變；生化儀分析各時間點(diǎn)的血生化指標(biāo)。結(jié)果：滅多威毒代動力學(xué)參數(shù)分別為AUC0-t（1 209.734±219.542）μg/h·L、MRT0-t（1.731±0.144）h、t1/2z（1.471± 0.277）h、Tmax0.25 h、CLz/F（9.576±1.816）L·h-1·kg-1和Vz/F（20.225±4.703）L/kg；光鏡下觀察，心肌、肝、腦組織均可見充血、水腫、細(xì)胞浸潤等病理學(xué)改變。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）在染毒后6 h時升高，與染毒前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；肌鈣蛋白-I（cTn-I）在染毒后2 h時升高，與染毒前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；膽堿酯酶（AchE）活性在染毒后0.25 h迅速降低，與染毒前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），6 h后恢復(fù)至正常水平。結(jié)論：滅多威灌胃染毒后的毒物代謝動力學(xué)符合二室模型，其體內(nèi)半衰期短，中毒后代謝迅速，對腦、心、肝、腎等臟器均有不同程度損害作用。

滅多威；毒物代謝動力學(xué)；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用；病理學(xué)改變；兔

滅多威（methomyl），化學(xué)名1-（甲硫基）亞乙基氨甲基氨基甲酸酯，為氨基甲酸酯類高毒殺蟲劑，具有觸殺和胃毒作用。常因意外接觸或誤服發(fā)生急性中毒，口服后數(shù)分鐘內(nèi)便可出現(xiàn)中毒癥狀，臨床表現(xiàn)與有機(jī)磷農(nóng)藥中毒相似，易誤診，嚴(yán)重中毒者常出現(xiàn)急性循環(huán)功能衰竭、肺淤血水腫、腦水腫及肝、腎功能衰竭等，病死率較高[1]。目前，國內(nèi)外對滅多威的研究主要為環(huán)境毒理學(xué)方面和臨床病例報道，有關(guān)動物毒代動力學(xué)和病理學(xué)方面研究報道較少。本研究采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/ MS）技術(shù)檢測兔血漿中滅多威濃度，并研究其在兔體內(nèi)的毒代動力學(xué)過程及病理學(xué)改變，為臨床滅多威中毒的診治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：SPF級日本大耳白兔16只，雌雄各半，體質(zhì)量1.8～2.7 kg，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 儀器與試劑：Esquire HCT質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ESI）（德國Bruker公司），Agilent 1200 HPLC高效液相色譜儀（美國Agilent公司），日立7060大型自動生化分析儀（日本日立株式會社），電子天平（德國Sartorius公司），5415D型高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司），熒光倒置顯微鏡（上海精密儀器公司），乙腈、甲酸、甲醇均為分析純（天津四友），滅多威（純度99%，國家農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所），實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理方法：16只兔隨機(jī)法分成毒代組（n=8）和正常組（n=8）。所有兔實(shí)驗(yàn)前禁食禁飲12 h，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的烏拉坦4 mL/kg經(jīng)兔耳緣靜脈麻醉動物，連接MedLab-U/4CS生物信號采集處理系統(tǒng)，記錄實(shí)驗(yàn)過程兔血壓、心率等生命體征變化。毒代組予滅多威溶液一次性灌胃，染毒劑量為12 mg/kg，分別于染毒后5 min、15 min、30

min、1 h、2 h、4 h、6 h及12 h經(jīng)兔耳緣靜脈取全血約1 mL，置于1.5 mL肝素鈉EP管中，離心10 min（4 000 r/min），取上層血漿，-20 ℃凍存待測。另取染毒前及染毒后15 min、2 h、6 h、12 h血清標(biāo)本各1 mL，用于血生化指標(biāo)測定。存活實(shí)驗(yàn)兔于染毒后12 h頸椎脫臼處死，迅速取出腦、心、肝、腎組織，固定于4%甲醛溶液中，石蠟包埋切片HE染色，用于病理學(xué)觀察。正常組予0.9%氯化鈉溶液灌胃，12 h后頸椎脫臼處死，取腦、心、肝、腎組織做病理學(xué)對照。

1.2.2 血漿滅多威濃度測定方法：①血漿樣品的處理：配制乙腈-甲醇溶液（9∶1），精密取血漿樣本200 μL，置1.5 mL EP管中，加入乙腈-甲醇溶液400 μL，沉淀蛋白，離心10 min（13 000 r/min），取上清液200μL進(jìn)行LC-MS/MS分析，進(jìn)樣量10μL。②色譜條件：柱溫30 ℃，流速：0.4 mL/min，柱子：Zorbax SB-C18（2.1 mm×150 mm，5μ m），流動相：乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脫；0 min，10%乙腈；4 min，80%乙腈；8 min，80%乙腈；9 min，10%乙腈；13 min，運(yùn)行完成。質(zhì)譜條件：ESI（電噴霧離子源），霧化氣壓力設(shè)為25 psi；干燥氣（N2）流速設(shè)為7 L/min，干燥氣溫度設(shè)為350 ℃，選擇離子模式（SIM）定量，滅多威m/z 163。

1.2.3 血生化指標(biāo)檢測方法：采用日立7060大型自動生化分析儀測定兔染毒前、后不同時間點(diǎn)血清標(biāo)本生化指標(biāo)，主要指標(biāo)包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、肌酸激酶（CK）、肌鈣蛋白-I（cTn-I）及膽堿酯酶（AchE）活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用表示，兩樣本均數(shù)的比較采用方差分析，非正態(tài)分布兩樣本均數(shù)比較采用秩和檢驗(yàn)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各采血時間點(diǎn)滅多威的血藥濃度，繪制血藥濃度-時間曲線，采用DAS（Drug and Statistics，version 2.0）程序計算毒代動力學(xué)參數(shù)，包括血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-t）、平均滯留時間（MRT0-t）、達(dá)峰時間（Tmax）、半衰期（t1/2z）、清除率（CLz/F）、表觀分布容積（Vz/ F）等。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性滅多威中毒兔行為學(xué)改變 正常組及毒代組染毒前兔呼吸、心率、血壓等生命體征平穩(wěn)。灌胃染毒后各組兔均先后出現(xiàn)呼吸加促、心率減慢、血壓下降、口鼻腔分泌物增多、四肢或全身肌肉抽搐，及大小便失禁等臨床癥狀體征。1只實(shí)驗(yàn)兔染毒后8 h出現(xiàn)心搏驟停，7只兔存活超過12 h，見表1。

2.2 兔滅多威灌胃染毒的毒代動力學(xué)結(jié)果 灌胃染毒后，血滅多威濃度隨時間變化血藥濃度-時間曲線見圖1。根據(jù)血滅多威濃度-時間曲線數(shù)據(jù)求得毒代動力學(xué)參數(shù)，見表2。

表1 滅多威中毒兔不同時間點(diǎn)臨床癥狀與體征 n（%）

圖1 家兔滅多威灌胃染毒平均血藥濃度-時間曲線

表2 兔滅多威灌胃染毒毒代動力學(xué)參數(shù)（n=8，）

表2 兔滅多威灌胃染毒毒代動力學(xué)參數(shù)（n=8，）

參數(shù)單位滅多威AUC（0-t）μg/L·h1 209.734±219.542 AUC（0-∞）μg/L·h1 288.353±227.123 MRT（0-t）h 1.731±0.144 MRT（0-∞）h 2.131±0.312 t1/2zh 1.471±0.277 Tmaxh0.25 CLz/FL·h-1·kg-19.576±1.816 Vz/FL/kg 20.225±4.703

2.3 滅多威對兔血液生化指標(biāo)的影響 兔滅多威染毒后6 h、12 h肝功能指標(biāo)ALT、AST、LDH均較染毒前明顯升高（P＜0.05），且高于正常參考值。染毒后腎功能指標(biāo)SCr、BUN較染毒前有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），各時間點(diǎn)數(shù)值均為正常參考值范圍。染毒后2 h、6 h及12 h心肌酶學(xué)指標(biāo)cTn-I均較染毒前明顯升高（P＜0.05），且高于正常參考值，染毒后6 h、12 h心肌酶學(xué)指標(biāo)CK均較染毒前明顯升高（P＜0.05），且高于正常參考值。染毒后15 min血AchE活性明顯低于正常參考值，較染毒前水平明顯下降（P＜0.05）；染毒后2 h血AchE活性逐漸恢復(fù)至正常參考值低限，仍明顯低于染毒前水平（P＜0.05）；染毒后6 h、12 h血AchE活性基本恢復(fù)正常參考值范圍，較染毒前稍低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.4 兔滅多威染毒后組織病理學(xué)改變 熒光倒置顯微鏡下顯示滅多威中毒后12 h兔腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管擴(kuò)張，血管周圍間隙增寬，大腦皮質(zhì)細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核固縮變形，見圖2a-b；心肌及心肌間質(zhì)可見散在的點(diǎn)狀出血，間質(zhì)疏松水腫，心肌纖維波浪樣變性，心肌凝固性變性，見圖3a-b；肝小葉結(jié)構(gòu)及細(xì)胞排列正常，出現(xiàn)彌漫性肝細(xì)胞水腫，細(xì)胞淡染，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，部分肝細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞壞死變形，見圖4a-b；腎臟充血表面見小灶狀出血，腎小球毛細(xì)血管腫脹充血，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，中性粒細(xì)胞浸潤，見圖5a-b。

表3 滅多威中毒兔不同時間點(diǎn)生化指標(biāo)變化（n≤8，）

表3 滅多威中毒兔不同時間點(diǎn)生化指標(biāo)變化（n≤8，）

與染毒前比：aP＜0.05

染毒后（h）0.25 2 6 12 ALT（U/L）9～50 34.85±10.29 36.28±9.84 42.10±7.12 52.41±9.80a137.48±36.01aAST（U/L）15～40 31.74±7.9835.723±8.77 36.59±8.09 46.37±8.84a88.20±26.85aLDH（U/L）109～245179.35±43.31184.08±41.79192.18±38.06234.72±39.07a305.24±50.52aSCr（μmol/L）45～8465.17±12.09 66.44±11.2 65.31±11.63 69.48±8.92 75.27±12.94 BUN（mmol/L）3.2～8.2 3.93±1.02 3.86±0.96 4.07±0.80 4.22±0.90 4.82±0.91 CK（U/L）26～14092.69±29.50 94.34±28.13103.78±26.34170.39±23.87a313.56±114.26acTn-I（mmol/L）0～0.0340.024±0.010 0.025±0.009 0.227±0.150a0.560±0.221a0.702±0.198aAchE（IU）30～8057.38±13.70 8.38±2.62a28.25±7.86a48.75±14.50 53.63±15.68生化項(xiàng)目參考值染毒前

圖2 滅多威中毒兔腦組織病理學(xué)改變（HE，×200）

圖3 滅多威中毒兔心肌組織病理學(xué)改變（HE，×200）

圖5 滅多威中毒兔肝臟組織病理學(xué)改變（HE，×200）

3 討論

目前國內(nèi)外對滅多威在土壤、水等環(huán)境中的測定方法報道[2-3]較多，但有關(guān)動物血漿中滅多威的測定方法鮮有報道。本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS法檢測兔血漿滅多威濃度，該方法簡便快速，無需對樣品做復(fù)雜的前處理，為滅多威中毒的臨床檢驗(yàn)及法醫(yī)鑒定提供參考。根據(jù)血藥濃度-時間曲線計算的毒代動力學(xué)參數(shù)提示滅多威毒物代謝動力學(xué)符合二室模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兔滅多威灌胃后胃腸吸收極快，血毒達(dá)峰時間僅15 min，與滅多威對AchE活性的抑制高峰重合，與國外研究報道[4]基本一致。此外，實(shí)驗(yàn)過程中兔血中毒物濃度與心率、AchE活性變化亦較為一致，染毒后5 min血毒濃度開始升高，血AchE活性降至低點(diǎn)，心率逐漸減慢，染毒后2 h血毒濃度明顯下降，AchE活性逐漸恢復(fù)，心率逐漸增快。國內(nèi)學(xué)者報道了人滅多威中毒后，60%患者可出現(xiàn)AchE活性的降低，部分患者甚至出現(xiàn)膽堿能危象，并認(rèn)為早期足量應(yīng)用阿托品可緩解膽堿能興奮的癥狀與體征，減輕膽堿能危象的表現(xiàn)[5]。以上研究提示，兔滅多威中毒早期心率減慢與滅多威抑制AchE活性相關(guān)。國內(nèi)學(xué)者趙丹[6]通過一定濃度的滅多威作用于家蠅胚胎細(xì)胞系MDEC-07114，發(fā)現(xiàn)低濃度滅多威對細(xì)胞無明顯抑制作用，隨藥物濃度增加，抑制作用增強(qiáng)，可見其毒性與血毒濃度密切相關(guān)。此外，研究結(jié)果顯示滅多威在兔體內(nèi)半衰期較短，清除速度快，染毒2 h后血毒濃度則已明顯下降。因此，臨床上滅多威中毒患者需盡早進(jìn)行洗胃、血液灌流等清除毒物治療[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)兔滅多威灌胃染毒后可出現(xiàn)心率減慢、血壓下降，部分兔出現(xiàn)四肢抽搐，表明滅多威具有中樞興奮和心血管系統(tǒng)抑制作用，與以往研究報道[8]基本一致。Hoizey等[9]報道滅多威經(jīng)口急性中毒后其代謝產(chǎn)物主要分布在腦、心、腎等組織臟器。國內(nèi)學(xué)者通過對滅多威急性中毒患者尸檢，發(fā)現(xiàn)患者腦血管充血水腫、心外膜出血、心肌纖維斷裂、肺淤血水腫等病理變化[10-11]。本研究病理學(xué)檢查同樣發(fā)現(xiàn)兔急性滅多威中毒后，心、腦、肝、腎等重要臟器均有不同程度損傷。血生化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，肝臟、心肌組織中毒早期均有不同程度損害，腎功能指標(biāo)（SCr、BUN）有升高趨勢，但12 h內(nèi)基本仍處于正常范圍，表明SCr、BUN不能較好地反映滅多威中毒早期腎功能損害情況，臨床上可能需更長時間監(jiān)測腎功能情況。滅多威所致上述重要臟器損害的具體毒性機(jī)制尚未完全明確，除早期抑制AchE活性外，過氧化損傷可能參與組織細(xì)胞損害全過程[13]。因此，臨床上患者血清AchE活性恢復(fù)正常后，仍需注意監(jiān)測，及時評估患者心、腦、肝、腎等組織臟器功能損害情況，并加以保護(hù)。本實(shí)驗(yàn)僅對單劑量滅多威灌胃染毒進(jìn)行毒代動力學(xué)研究，其結(jié)果對滅多威中毒的臨床診治具有一定的參考意義。

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（本文編輯：吳彬）

Toxicokinetics of methomyl in rabbits

WANG Zhiyi1,WANG Chunlong2,WANG Xianqin3, CHEN Jin1, SUNLaifang1, MA Jianshe2. 1.Department of Emergency, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.School of Basic Medical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou , 325035; 3.Analytical and Testing Center, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To observe the toxicokinetics of acute methomyl poisoning in rabbits, and to explore its damaging effects on tissue and organ. Methods: Disposable gavageing methomyl dose 12 mg/kg, to observed symptoms and signs at different time points. The process of metabolism and absorption of methomyl were detected by Liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry in rabbit plasma, drawing concentrationtime curve. The toxicokinetic parameters were analyzed and calculated by DAS 2.0 software. The pathological changes of brain, heart, liver, kidney were observed under inverted fluorescence microscope. Blood biochemistry was analyzed with biochemical analyzer at each time point. Results: The parameters were AUC0-t(1 209.734± 219.542) μg/L·h. MRT0-t(1.731±0.144) h, t1/2z(1.471±0.277) h, Tmax0.25 h, CLz/F (9.576±1.816) L·h-1·kg-1, Vz/F (20.225±4.703) L/kg in methomyl toxicokinetics. The pathological changes, cellular infiltration and edema were visible under light microscope in heart, liver, brain. Compared with previous exposure, the Alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK) elevated after exposure for 6 h, the differences were statistically significant (P＜0.05). Troponin-I (cTn-I) increased at 2 h after exposure, the differences were statistically significant (P＜0.05). Cholinesterase (AchE) activity decreased rapidly after 0.25 h exposure, the differences were statistically significant (P＜0.05), returned to normal levels after exposure for 6 h. Conclusion: The toxicokinetics of Methomyl gavaged poison is in accordance with twocompartment model, its half-life in vivo is short, metabolism is rapid after poisoning, different degrees damages are detected in the brain, heart, liver, kidney organs.

methomyl; toxicokinetics; liquid chromatography mass spectrometry; pathological changes; rabbits

R994.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.07.001

2015-01-23

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81401558）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY14H230001）；浙江省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目（2014KYA 144）；溫州市公益性科技計劃項(xiàng)目（Y20140493）。

王志翊（1979-），男，浙江溫州人，主治醫(yī)師，碩士。

孫來芳，副主任醫(yī)師，Email：sunlaifang@163.com。