李 迷， 王素英， 董世瑞， 汪群梅， 吳躍梅， 侯惠靜

(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院 天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134)

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TTC-脫氫酶還原法測(cè)定螺旋藻細(xì)胞活性的條件優(yōu)化

李 迷， 王素英*， 董世瑞， 汪群梅， 吳躍梅， 侯惠靜

(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院 天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134)

為確定氯化三苯基四氮唑(TTC)-脫氫酶還原法測(cè)定螺旋藻細(xì)胞活性的最優(yōu)條件，首先通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)影響藻細(xì)胞活性測(cè)定的TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)、緩沖液pH、提取劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度進(jìn)行分析，選定各因素的變化范圍，再利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，在藻細(xì)胞活性測(cè)定的最適培養(yǎng)溫度下，對(duì)TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)、緩沖液pH、提取劑體積分?jǐn)?shù)、培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行3水平優(yōu)化試驗(yàn)。最后確定優(yōu)化的TTC-脫氫酶還原法測(cè)定螺旋藻細(xì)胞活性的條件為TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、緩沖液pH 8.0～8.5、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、培養(yǎng)時(shí)間5 h、培養(yǎng)溫度35 ℃。在此條件下所測(cè)藻細(xì)胞活性最高，為螺旋藻細(xì)胞活性的評(píng)價(jià)提供了一定參考。

螺旋藻；細(xì)胞活性檢測(cè)；氯化三苯基四氮唑(TTC)；脫氫酶

藻種保藏是螺旋藻研究和規(guī)?；B(yǎng)殖的重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞活性是評(píng)價(jià)各種保藏方法的關(guān)鍵指標(biāo)。已有的研究表明，藻種細(xì)胞活性的測(cè)定有間接法和直接法，其中間接法包括藻細(xì)胞密度、含藻水中溶解氧含量、葉綠素含量、光密度值等指標(biāo)的測(cè)定[1-3]；直接法是對(duì)藻進(jìn)行再培養(yǎng)，根據(jù)再培養(yǎng)時(shí)藻體的生長(zhǎng)狀態(tài)判斷細(xì)胞的活性。間接法不能對(duì)細(xì)胞的活性進(jìn)行直接判斷，結(jié)果存在一定誤差，而直接法消耗的時(shí)間較長(zhǎng)。為了尋找靈敏、快速、簡(jiǎn)便的藻細(xì)胞活性直接檢測(cè)手段，本課題組在螺旋藻藻株保藏方法研究中，借鑒已在生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的脫氫酶活性檢測(cè)法——氯化三苯基四氮唑(TTC)法對(duì)藻細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。該方法能夠反映生物體的細(xì)胞活性，常用于植物種子或根莖的細(xì)胞活力測(cè)定[4-7]、活性污泥的活性監(jiān)測(cè)[8-9]、動(dòng)物細(xì)胞及細(xì)菌活性的測(cè)定[10-13]。在藻細(xì)胞活性測(cè)定方面，Chang等[14]用TTC-脫氫酶還原法測(cè)定了大型海藻帶石莼(Ulvafasciata)在不同鹽度環(huán)境下的活性狀況。Nam等[15]將TTC法應(yīng)用于測(cè)定海藻細(xì)胞活性。梁文艷等[16]發(fā)現(xiàn)TTC-脫氫酶活性測(cè)定法可用于銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)活性檢測(cè)，并能很好地進(jìn)行定量測(cè)定。解軍[17]對(duì)藻類TTC-脫氫酶活性檢測(cè)法的研究表明，該法可很好地應(yīng)用于實(shí)際水樣中藻含量的測(cè)定及殺藻處理后的活體藻的檢測(cè)。但是，不同生物體利用TTC作為氫受體的能力不同，因此反應(yīng)的最佳條件也有所不同。本文擬對(duì)影響TTC-脫氫酶還原法測(cè)定螺旋藻細(xì)胞活性的條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在尋找簡(jiǎn)便、省時(shí)、規(guī)范的螺旋藻細(xì)胞活性評(píng)價(jià)方法，為螺旋藻的相關(guān)研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 鹽澤螺旋藻(Spirulinasubsalsa),購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生植物研究所，編號(hào)為FACHB351。

1.1.2 培養(yǎng)基 改進(jìn)的Zarrouk培養(yǎng)基(AB培養(yǎng)基)，1 L AB培養(yǎng)基包括993 mL (A、B、C)、6 mL PIV、1 mL A5。其中A: NaHCO313.61 g，Na2CO34.03 g，KH2PO40.5 g，NaNO32.5 g；B:K2SO41 g，NaCl 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g；C:CaCl2·2H2O 0.04 g;PIV (g/L): C10H16N2Na2O80.75，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.097，MnCl2·4H2O 0.041，ZnCl20.005，CoCl2·6H2O 0.002，Na2MoO4·2H2O 0.004；A5 (g/L):H3BO32.86，NaCl·4H2O 1.81，Na2CO30.22，MnSO4·7H2O 2.5，CuSO4·5H2O 0.007 4， Na2MoO40.002 1。將A、B、C、PIV、A5分別濕熱滅菌(121 ℃,20 min)，待冷卻后混勻使用。

1.1.3 主要試劑及配制 0.2%TTC溶液的配制：稱取0.2 g TTC溶于100 mL Tris-HCl(pH 7.5)緩沖溶液中，避光保存。氫氧化鈉、乙醇、正己烷均為分析純。

1.1.4 儀器 PHSJ-5型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)，Neofuge 18R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(香港力康發(fā)展有限公司)，單列六孔電熱恒溫水浴鍋(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司)，U-5100分光光度計(jì)(日本 Hitachi 公司)。

1.2 方法

取4 mL藻液(細(xì)胞密度約為2×105個(gè)/mL)于10 mL離心管中，10 000 r/min離心20 min，去除培養(yǎng)基后用蒸餾水清洗2次，加入5 mL 0.2% TTC，置于35 ℃恒溫水浴，暗處發(fā)色培養(yǎng)8 h后10 000 r/min離心20 min獲得藻泥，并用蒸餾水清洗2次后于沉淀中加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液(含0.01 mol/L NaOH)，室溫放置30 min后，加入3 mL正己烷震蕩2～3 min進(jìn)行三苯基甲臢(TPF)的萃取。穩(wěn)定數(shù)分鐘后測(cè)定正己烷萃取液在485 nm處的吸光度值，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 在保持其他因子不變的條件下，變化單一因子，研究TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%)、緩沖液pH (6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0)、提取劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)(0%、20%、40%、60%、80%、100%)、培養(yǎng)溫度(20、25、30、35、40、45和50 ℃)和培養(yǎng)時(shí)間(0、2、4、6、8、10和12 h)對(duì)藻細(xì)胞脫氫酶活性測(cè)定的影響。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在藻細(xì)胞活性測(cè)定的最適培養(yǎng)溫度下，選擇TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)、緩沖液pH、提取劑體積分?jǐn)?shù)和培養(yǎng)時(shí)間為考察因素，以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得的各因素適宜范圍作為參考依據(jù)，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，以485 nm處吸光度值作為篩選酶活性測(cè)定條件的指標(biāo)，按L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活性測(cè)定的影響 用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的TTC溶液進(jìn)行脫氫酶活性的測(cè)定(圖1)，結(jié)果表明TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)吸光度最大，達(dá)到1.43；低于0.2%時(shí)，因TTC氫受體不足，生成的TPF較少，吸光度較低；當(dāng)TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.2%時(shí)，TPF的生成量隨著TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加逐漸減少，這是由于TTC對(duì)細(xì)胞存在一定的毒性，過高的TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)抑制酶活性，使反應(yīng)終止。通過單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)0%與1.0% TTC對(duì)脫氫酶活性測(cè)定的影響無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)由于其對(duì)細(xì)胞的毒性，致使脫氫酶反應(yīng)幾乎沒有發(fā)生。

圖1 TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活性測(cè)定的影響

2.1.2 緩沖液pH對(duì)酶活性測(cè)定的影響 pH值可改變底物的帶電狀態(tài)，從而影響底物分子與酶的結(jié)合。 由圖2可知，TTC作為人工氫受體，當(dāng)反應(yīng)體系的pH值小于7. 5時(shí)，很難被細(xì)胞呼吸過程中產(chǎn)生的氫原子還原生成TPF；pH大于7.0時(shí)， TPF的生成量明顯增加，當(dāng)pH值大于8.0時(shí)，TTC-脫氫酶還原反應(yīng)開始受到抑制，吸光度值呈下降趨勢(shì)。對(duì)緩沖液pH進(jìn)行單因素方差分析，并對(duì)其進(jìn)行多重比較，pH 6.0與pH 6.5對(duì)酶活性測(cè)定的影響無(wú)顯著差異(P>0.05)，其他不同pH的緩沖液對(duì)酶活性測(cè)定的影響均存在顯著差異(P<0.01)，說(shuō)明當(dāng)緩沖液pH介于6.5～8.0時(shí)，隨著pH值的增加，脫氫酶活性顯著增加，超過8.0后，脫氫酶活性則明顯下降。

圖2 緩沖液pH對(duì)酶活性測(cè)定的影響Fig.2 Effect of buffer solution pH on viability detection

2.1.3 提取劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)對(duì)酶活性測(cè)定的影響 TTC-脫氫酶還原反應(yīng)生成的TPF由于不溶于水溶液而沉積在細(xì)胞中，需要用有機(jī)溶液提取后測(cè)定。實(shí)驗(yàn)選擇不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行了提取效率的比較，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，乙醇的體積分?jǐn)?shù)低于50%時(shí)提取效率較低，當(dāng)高于50%后提取效率明顯增大。100%的乙醇由于與正己烷完全互溶，從而使吸光度值下降。通過單因素方差分析，可知50%與60%的乙醇對(duì)酶活性測(cè)定的影響無(wú)顯著差異(P>0.05)，略低于80%乙醇的提取效率，考慮到增加乙醇體積分?jǐn)?shù)會(huì)增大藻細(xì)胞中其他色素的干擾，故正交試驗(yàn)中提取劑體積分?jǐn)?shù)設(shè)為50%、55%、60%。

圖3 提取劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)酶活性測(cè)定的影響

2.1.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活性測(cè)定的影響 根據(jù)酶活性的測(cè)定原則，培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)盡量短些，以避免因基質(zhì)濃度下降、產(chǎn)物的形成以及酶的變性所帶來(lái)的不良影響。但培養(yǎng)時(shí)間過短會(huì)使酶促反應(yīng)生成的被檢測(cè)物質(zhì)的量太少，難以定量檢測(cè)，因此應(yīng)選擇適宜的培養(yǎng)時(shí)間。由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為4 h時(shí)，TPF的生成量最大，此時(shí)吸光度值達(dá)到1.38；隨著培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，吸光度小幅下降，但趨于平衡，說(shuō)明生成的TPF比較穩(wěn)定，在一定的時(shí)間內(nèi)不會(huì)被空氣中的氧氧化而褪色。對(duì)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行單因素方差分析，可知培養(yǎng)時(shí)間為4 h和6 h時(shí)脫氫酶活性無(wú)顯著差異(P>0.05)，但培養(yǎng)時(shí)間4 h與8、10、12 h的脫氫酶活性存在顯著差異(P<0.01)，所以培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)控制在4～6 h。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活性測(cè)定的影響

2.1.5 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活性測(cè)定的影響 酶的催化作用，只有在一定溫度下才能表現(xiàn)出來(lái)。通常酶的作用速度隨溫度升高而加速，但溫度升高到一定限度后，酶的活性就要鈍化，直至完全失活。由圖5可看出，脫氫酶反應(yīng)在發(fā)色培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí)吸光度最大(為1.37)，隨后隨著溫度的上升吸光度值逐漸降低。此溫度也與螺旋藻的最適生長(zhǎng)溫度一致。對(duì)培養(yǎng)溫度進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度為20、25與40 ℃時(shí)的脫氫酶活性無(wú)顯著差異(P>0.05)，且明顯低于培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí)的脫氫酶活性(P<0.01)，所以脫氫酶反應(yīng)的最適溫度為35 ℃。

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活性測(cè)定的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由單因素實(shí)驗(yàn)可知脫氫酶反應(yīng)的最適溫度為35 ℃，且大量的研究表明Spirulina subsalsa的最佳生長(zhǎng)溫度為35～38 ℃，考慮到在螺旋藻的最適生長(zhǎng)溫度下細(xì)胞內(nèi)脫氫酶活性也最高，因此本研究在固定發(fā)色培養(yǎng)溫度為35 ℃的前提下，考察TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)、緩沖液pH值、提取劑體積分?jǐn)?shù)和培養(yǎng)時(shí)間的相互作用對(duì)TTC-脫氫酶法測(cè)定藻細(xì)胞活性的影響，以獲得各種條件的最優(yōu)組合。因素水平見表1。

極差R反映了影響因素對(duì)反應(yīng)體系的影響，R越大，影響越顯著。由表2直觀分析可知，各因素水平的變化對(duì)TTC-脫氫酶還原法測(cè)定螺旋藻細(xì)胞活性影響的次序由大到小依次為TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)、培養(yǎng)時(shí)間、緩沖液pH、提取劑體積分?jǐn)?shù)。由表3方差分析可知因素A、B、C、D對(duì)酶活性的測(cè)定均有極顯著影響(P<0.01)。對(duì)4個(gè)因素進(jìn)行多重比較，并結(jié)合直觀效應(yīng)分析可知，TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.2%、0.3%存在極顯著差異(P<0.01)，且酶活性由高到低為0.1%、0.2%、0.3%，故TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最優(yōu)水平選擇0.1%；在緩沖液pH為8.0和8.5時(shí)，脫氫酶活性明顯高于pH 7.5(P<0.01)，但前兩者差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明脫氫酶活性測(cè)定時(shí)緩沖液的最適pH為8.0～8.5；提取劑體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，酶活性明顯高于50%、55%(P<0.01)，而后兩者酶活性差異不顯著(P>0.05)，所以提取劑體積分?jǐn)?shù)以60%為宜；培養(yǎng)時(shí)間為5 h時(shí)酶活性明顯高于3 h與4 h(P<0.01)，其中培養(yǎng)時(shí)間為3 h、4 h時(shí)酶活性差異不顯著(P>0.05)，因此培養(yǎng)時(shí)間選擇5 h。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

表3 正交設(shè)計(jì)方差分析表

注：F0.95(2,18)=3.55,F0.99(2,18)=6.01,**表示存在極顯著性差異

3 討 論

通過單因素和正交試驗(yàn)，在脫氫酶反應(yīng)的最適培養(yǎng)溫度35 ℃條件下，TTC-脫氫酶還原法測(cè)定藻細(xì)胞活性的最優(yōu)條件組合為TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、緩沖液pH 8.0～8.5、提取劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)60%、培養(yǎng)時(shí)間5 h。為螺旋藻細(xì)胞活性的評(píng)價(jià)提供了一種省時(shí)、操作簡(jiǎn)單、現(xiàn)象直觀的方法。但在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，通過不同方法保藏的Spirulinasubsalsa在細(xì)胞活性較低時(shí)，TPF生成量較少，被乙醇提取的細(xì)胞色素所占的比例增加，因而對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大的影響，因此實(shí)驗(yàn)參考了梁文艷等[18]的研究結(jié)論，即采用含0.001～0.01 mol/L NaOH的乙醇提取TPF后，再用正己烷進(jìn)行萃取，這樣可在一定程度上去除細(xì)胞色素的干擾，但要使TTC-脫氫酶法更準(zhǔn)確反映細(xì)胞活力的大小，作為評(píng)價(jià)螺旋藻保藏方法的唯一依據(jù)，還需要對(duì)測(cè)定的前處理過程進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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Condition Optimization of TTC-Dehydrogenase Reduction Method To DetermineSpirulinaCell Activity

LI Mi, WANG Su-ying, DONG Shi-rui, WANG Qun-mei, WU Yue-mei, HOU Hui-jing

(Coll.ofBio-Technol&FoodSci.,TianjinUni.ofCommerce,TianjinKeyLab.ofFoodBio-Technol.,Tianjin300134)

In order to determine the optimal conditions of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC)-dehydr-ogenase reduction method onSpirulinacell activity (SCA), the variable range of TTC mass fraction, pH of buffer solution, volume fraction of extractant (ethanol), incubation temperature and time that affected SCA were analyzed using single factor experiment. Then under the most suitable incubation temperature of the determination of SCA, the optimal conditions of TTC-dehydrogenase assay on SCA activity including the mass fraction of the TTC, pH of buffer solution, volume fraction of extractant content and incubation time were obtained by orthogonal experiment. The optimized conditions of TTC-dehydrogenase reduction method to determine SCA were finally confirmed that TTC mass fraction at 0.1%, pH of buffer at 8.0～8.5, the volume fraction of ethanol at 60%, incubated for 5 h at 35 ℃. Under this condition the SCA reached the highest. The experiment results provided a certain theoretical basis for evaluating SCA.

Spirulina; cell activity detection; 2,3,5-triphenyl tetrazolium Chloride (TTC); dehydrogenase

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270050)；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(TD12-5049)

李迷 女，碩士研究生。研究方向?yàn)槲⑸镔Y源。E-mail:limi512@163.com

* 通訊作者。女，教授，博士。研究方向?yàn)槲⑸镔Y源開發(fā)與利用。E-mail:wsying@tjcu.edu.cn

2014-12-18；

2015-01-15

Q949.22

A

1005-7021(2015)06-0033-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.006