夏 杰， 王 蓉

(黃岡職業(yè)技術學院 醫(yī)藥衛(wèi)生學院，湖北 黃岡 438000)

?

病原體逃逸中性粒細胞胞外誘捕網機制

夏 杰， 王 蓉

(黃岡職業(yè)技術學院 醫(yī)藥衛(wèi)生學院，湖北 黃岡 438000)

中性粒細胞胞外誘捕網(NETs)是新發(fā)現(xiàn)的中性粒細胞抗病原機制，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。但病原體在進化中形成了針對NETs的免疫逃逸機制。不同的病原體逃逸NET的機制不同，本文主要介紹3種機制：降解NETs-DNA、表面分子機制和NETosis調控。

中性粒細胞；中性粒細胞胞外誘捕網；免疫逃逸；病原體

中性粒細胞是人體天然免疫系統(tǒng)抗病原微生物的第一線效應細胞。中性粒細胞通過吞噬作用、脫顆粒作用與形成胞外誘捕網(NETs)參與病原體感染的免疫應答反應[1]。NETs是近年來發(fā)現(xiàn)的中性粒細胞新的抗病原體機制。2004年，Brinkmann等[2]發(fā)現(xiàn)IL-8或PMA處理過的中性粒細胞在胞外產生一種纖維狀結構，進一步研究發(fā)現(xiàn)這些纖維狀結構由染色質DNA、組蛋白以及顆粒源蛋白構成并且具有抗菌作用。利用透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)、免疫熒光和活細胞成像技術，Brinkmann等觀察到中性粒細胞在IL-8、PMA的刺激作用下，核膜和顆粒膜崩解，染色質DNA、組蛋白以及顆粒源蛋白等成分混合，并隨著細胞膜的崩解而釋放出來，即NETs。中性粒細胞的這種死亡程序稱為NETosis。NETs是中性粒細胞針對病原體的天然免疫反應。NETs結構阻止了病原體擴散，并維持抗菌物質在局部聚集，有利于病原體及其毒力因子的清除和殺滅[3]。NETs對細菌、病毒、真菌等病原體都有不同程度的抗感染作用，而這些病原體也通過不同的策略逃逸NETs的捕獲[4]。本文主要討論病原微生物針對NETs的免疫逃逸機制。

1 降解NETs-DNA

1.1 脫氧核糖核酸酶(DNase)

許多病原菌可以產生DNase，早已證明這種酶利于感染菌的擴散。最近的研究表明DNase與病原微生物逃逸NETs的捕殺有關。A群鏈球菌(GAS)與許多人類疾病相關。Sumby等[5]對M1血清型 GAS菌株MGAS5005 基因測序，發(fā)現(xiàn)了3個編碼DNases的基因。進一步通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，這3個基因滅活的突變菌株毒性明顯較低，活體內清除速度更快。Buchanan等[6]假設GAS通過DNase降解NETs-DNA逃逸NETs介導的中性粒細胞殺傷作用，他們運用等位基因替代、單基因互補和異源表達等分子遺傳學方法，利用壞死性筋膜炎小鼠模型作為感染載體，對能產生DNase的野生型M1血清型GAS菌株和不能產生DNase的同基因型M1ΔSda1突變菌株進行對照試驗。實驗結果表明，DNase能促進NETs的降解，從而增強GAS在體內的存活能力和毒性；相反，DNase阻斷劑G-肌動蛋白(G-actin)可在體外增強中性粒細胞清除GAS，體內降低GAS毒性。所以，表達DNase的GAS能對抗NET介導的殺菌途徑。因此，設計消除DNAse活性或維持NETs完整性的藥物，可以作為抗菌治療的輔助治療藥物。

1.2 核酸內切酶A(Endonuclease A, EndA)

肺炎鏈球菌是社區(qū)獲得性肺炎最常見的病原體，大量中性粒細胞浸潤是其主要特點之一。由于肺炎鏈球菌表達抗吞噬莢膜，所以在感染早期中性粒細胞吞噬作用起效甚微。已知肺炎鏈球菌TIGR4(血清型4)endA基因是化膿性鏈球菌DNase基因spd和sda的同源基因，表達一種膜結合核酸內切酶(EndA)。Beiter等[7]用TIGR4感染PMA處理的中性粒細胞，5 min后觀察到TIGR4被NETs捕獲，但并沒有檢測到TIGR4被NETs或吞噬作用殺滅，他們將釋放NETs的中性粒細胞分別與牛胰源DNase、TIGR4Δ(endA)(endA敲除突變體)和TIGR4共培養(yǎng)30 min，結果顯示，牛胰源DNase或TIGR4能降解NETs，破壞NETs完整性，而TIGR4Δ(endA)不能破壞NETs完整性。因此，EndA具有DNase功能，能破壞NETs的結構。為了證實EndA是否有助于GAS逃逸NETs，Beiter等[7]進一步將PMA處理的中性粒細胞分別感染 TIGR4(血清型4)、TIGR4Δ(endA)(endA敲除突變體)和TIGR4Δ(endA) (endA) (逆轉體)3種菌株，30 min后，不能產生EndA的TIGR4Δ(endA)依然被NETs纏繞，而能產生EndA的TIGR4和TIGR4Δ(endA)(endA)逃離NETs，并且NETs被嚴重破壞。因此，EndA能夠有效降解NET-DNA骨架，逃逸NETs的捕殺；將這種核酸內切酶作為靶點是一種有前途的抗菌治療策略[8]。Beiter等[7]還檢測了7種不同莢膜型(血清型1、3、4、7F、14、19F)肺炎鏈球菌菌株，表明除血清型1菌株外，其他都表現(xiàn)出很強的EndA活性。因此，降解NETs是各型肺炎鏈球菌逃逸NETs的普遍策略。盡管所有致病肺炎鏈球菌都被檢測出表達EndA并能破壞NETs，但不同類型菌株表達EndA水平不同，相應致病能力也不同。因此，對于這種高度可變菌種而言，不同菌株可能被賦予不同的致侵襲性疾病的風險。

2 病原表面分子機制

2.1 分子模擬

唾液酸(Sias)一般只在多細胞生物細胞表面表達，是一類定位于復合多糖末端的九碳糖酸[9]。人類嗜中性粒細胞 Siglec-9是一種能夠識別Sias的凝集素，Siglec-9識別宿主細胞Sias作為“自我”的標志，負性調節(jié)中性粒細胞活性[10]。少數(shù)細菌也表達Sias，如B群鏈球菌(GBS)、大腸埃希菌K1(EscherichiacoliK1)、腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)等[9]。BSAb是一種能阻斷Sias與Siglec-9結合的抗Siglec-9IgG單克隆抗體，NBSAb是一種不能阻斷Sias與Siglec-9結合的抗Siglec-9IgG單克隆抗體，Carlin等[10]利用這兩種抗體作為區(qū)分是否阻斷Sias結合位點的試劑，研究了GBS與中性粒細胞的相互作用關系。實驗顯示，存在BSAb情況下，相對于NBSAb，GBS刺激中性粒細胞產生更強的氧爆作用，釋放更多的顆粒蛋白酶和產生更多的NETs。因此，GBS可通過Sias或Siglec-9依賴的方式反式作用于中性粒細胞，降低其活性。

雖然沒有文獻報道銅綠假單胞菌(PA)可以合成Sias，但Khatua等[11]證實PA可以從周圍環(huán)境中直接吸附Sias，并通過與中性粒細胞siglec-9 的交互作用減少其活性氧族(ROS)和彈性蛋白酶(elastase)的產生，進而弱化ROS和elastase介導的 NETs形成。PA通過這種方式實現(xiàn)了免疫逃逸。在某些病理情況下血清Sias水平顯著升高，如風濕性關節(jié)炎、骨髓瘤、晚期癌和肺結核等[12]。而這些疾病對PA高度易感，可能與 PA吸附Sias有關。和PA一樣，某些革蘭陰性菌也可以從周圍環(huán)境吸附Sias，如嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)、多殺巴斯德菌(Pasteurellamultocida)和 杜克雷嗜血桿菌(Haemophilusducrey)等[13]。Khatua等[11]認為，吸附Sias可能是那些不能合成Sias病原體實現(xiàn)免疫逃逸的一種普遍性的方式。

2.2 分子限定

煙曲霉菌(A.fumigatus)是一種重要的空氣傳播致病真菌，致使免疫力低下的患者發(fā)生致命感染。分生孢子(conidia)是真菌產生的一種形態(tài)較小的無性繁殖體，被吸入呼吸道后遭遇由巨噬細胞和中性粒細胞構成的天然免疫系統(tǒng)。分生孢子主要由巨噬細胞和中性粒細胞殺滅，菌絲由中性粒細胞殺滅[14]。已知疏水蛋白RodA(hydrophobin RodA)是煙曲霉菌表面主要的蛋白質組分， RodA主要表達于休眠分生孢子(resting conidia),在腫脹分生孢子(swollen conidia)上數(shù)量減少，菌絲(hyphae)完全缺乏[15]。Aimanianda等[16]證實RodA可以降低天然免疫系統(tǒng)的活性。Bruns等[14]用雙光子顯微鏡技術(two-photon microscopy)適時觀察了煙曲霉菌感染小鼠的肺組織，發(fā)現(xiàn)中性粒細胞浸潤并形成NETs。為了進一步明確RodA與NETs的關系，Bruns等[14]分析了因ΔrodA突變RodA缺陷的休眠和腫脹分生孢子，明確了RodA對NETs形成的影響。結果表明，與野生型相比，中性粒細胞遇到ΔrodA突變腫脹和休眠分生孢子時NETs形成顯著增加。其中ΔrodA突變休眠分生孢子誘導NETs形成的作用比任何形式的菌絲還強。將純化RodA 加入ΔrodA突變分生孢子可減少NETs形成。這表明RodA是抑制中性粒細胞NETs形成的主要因素，同時也提示，休眠體分生孢子本身能強效誘導NETs形成，只是這種作用被RodA所屏蔽。Bruns等[14]推測是RodA隱藏了免疫活性蛋白或胞壁糖等成分，這種推測可以解釋為何菌絲比休眠或腫脹分生孢子具有更強的誘導NETs形成的能力。因此, RodA有利于曲霉菌逃逸NETs介導的免疫應答，構成了煙曲霉菌逃逸中性粒細胞的一個分子限定途徑。

3 NETs/NETosis調控

Jenne等[17]通過小鼠感染模型實驗證明病毒感染可以使中性粒細胞在肝臟脈管系統(tǒng)募集并誘導NETs形成，同時指出NETs在早期抗病毒免疫，限制病毒擴散方面發(fā)揮重要作用。然而，很多研究表明在某些炎癥性疾病中NETs表現(xiàn)出組織損傷特性，包括某些病毒性肺炎。

貓白血病病毒(Feline leukemia virus ，F(xiàn)eLV)是一種在貓科動物間傳播的逆轉錄病毒，60%的感染動物可建立體液免疫形成高滴度中和抗體，30%不能建立有效體液免疫而發(fā)生持久病毒感染，可導致致命的腫瘤，造血系統(tǒng)的退化以及免疫系統(tǒng)缺陷，因此，F(xiàn)eLV感染常被人類用來作為研究HIV的模型[18]。已知FeLV可以降低中性粒細胞的功能。為了明確FeLV對NETs形成的影響，Wardini等[19]對FeLV陰性和FeLV陽性無癥狀以及 FeLV陽性有癥狀的3組貓的中性粒細胞進行對照研究。在利士曼原蟲前鞭毛體(Leishmaniapromastigotes)的刺激下，F(xiàn)eLV陰性和FeLV陽性無癥狀貓中性粒細胞NETs形成量顯著高于FeLV陽性有癥狀貓中性粒細胞。然而，在沒有利士曼原蟲前鞭毛體的刺激時候，情況卻完全相反。這些現(xiàn)象表明NETs被FeLV調節(jié)；FeLV感染耗竭了NETs抗菌機制，為其他病原體逃逸NET創(chuàng)造了條件。

HIV-1屬于慢病毒亞科的一種逆轉錄病毒，通過感染人CD4+T細胞和巨噬細胞摧毀人的免疫系統(tǒng)，最終發(fā)展為AIDS。已知髓過氧化物酶(MPO)和α-防御素(α-defensin)存在于NETs上，可滅活HIV-1[20]。Saitoh等[21]對NETs抗HIV-1反應進行了深入研究。研究顯示HIV誘導NETosis，并且通過超分辨率結構照明顯微鏡(SR-SIM)觀察到HIV被NETs捕獲。NETs不僅能限制HIV，還能通過MPO和α-防御素降低其感染性。因此，NETs在天然免疫抗HIV中發(fā)揮重要作用。然而，HIV可以雇傭某些免疫細胞以促其繁殖，尤其是樹突狀細胞(dendritic cells，DCs) 。如HIV與DCs特異性細胞間粘附分子DC-SIG N(也稱為CD209)結合，促進感染CD4+T 細胞[22]。Saitoh等[21]研究表明，HIV與孤立DCs結合導致一種NETosis抑制因子產生；重組gp120(HIV的一種膜糖蛋白)處理DCs可產生相同效應；抗CD209中和抗體可阻斷此效應，深入的分析發(fā)現(xiàn)，這種抑制因子是 IL-10。因此，HIV不僅通過DCs的CD209感染CD4+T細胞,也通過依賴gp120-CD209途徑下調NETosis，逃避NETs的捕殺。HIV感染個體容易繼發(fā)肺結核、肺炎鏈球菌等感染。所以，這些發(fā)現(xiàn)在抗艾滋病治療中如何維持天然免疫功能有重大指導意義。

綜上所述，NET是新發(fā)現(xiàn)的中性粒細胞抗病原機制。病原體在進化中形成了針對NETs的免疫逃逸現(xiàn)象。這種針對NETs的免疫逃逸現(xiàn)象反過來也證明了NETs在天然免疫中的重要作用。病原體逃逸NETs的原理在臨床上已經有所運用，如臨床上使用重組脫氧核糖核酸酶(rhDNAse)清除肺囊性纖維化(CF)患者氣道內的濃稠黏液，主要成分是NETs，其實是模仿鏈球菌的策略；對 AIDS而言，如果能消減 IL-10的效應可能有利于降低繼發(fā)性感染率。然而，針對病原體逃逸NETs機制的臨床療法還有待進一步研究。所以，深入研究病原逃逸NETs的分子機制，為預防和治療感染性疾病提供新的研究方向和前景。

[1] 周劍濤，姚振國，丁海峰.游離中性粒細胞胞外誘捕網DNA的研究進展[J].分子診斷與治療雜志，2013，5(2)：134-138.

[2] Brinkmann V, Reichard U, Goosmann C, et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria[J].Science,2004,303:1532-1535.

[3] Brinkmann V, Zychlinsky A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs[J]. Nat Rev Microbiol，2007，5:577-582.

[4] Sinuhe H, Stavros G, Chanchal S C, et al. Modulation of neutrophil NETosis: interplay between infectious agents and underlying host physiology[J]. Semin Immunopathol, 2013, 35(4): 439-453.

[5] Sumby P, Barbian KD, Gardner DJ, et al. Extracellular deoxyribonuclease made by group AStreptococcusassistspathogenesis by enhancing evasion of the innate immune response[J]. Proc.Natl. Acad. Sci，2005, 102: 1679-1684

[6] Buchanan JT, Simpson AJ, Aziz RK, et al. DNase Expression Allows the Pathogen Group A Streptococcus to Escape Killing in Neutrophil Extracellular Trap[J]. Curr Biol, 2006, 16(4):396-400.

[7] Beiter K, Wartha F, Albiger B, et al. An endonuclease allows Streptococcus pneumoniae to escape from neutrophil extracellular traps[J]. Current biology:CB, 2006, 16:401-407.

[8] Peterson EJ, Kireev D, Moon AF, et al. Inhibitors ofStreptococcuspneumoniaesurface endonuclease EndA discovered by high-throughput screening using a PicoGreen fluorescence assay[J]. J Biomol Screen, 2013, 18:247-257.

[9] Khatua B, Bhattacharya K, Mandal C. Sialoglycoproteins adsorbed byPseudomonasaeruginosafacilitate their survival by impeding neutrophil extracellular trap through siglec-9[J]. Leukoc Biol, 2012, 91:641-655.

[10]Carlin AF, Uchiyama S, Chang YC, et al. Molecular mimicry of host sialylated glycans allows a bacterial pathogen to engage neutrophil Siglec-9 and dampen the innate immune response[J]. Blood, 2009, 113:3333-3336.

[11]Khatua B, Bhattacharya K, Mandal C. Sialoglycoproteins adsorbed byPseudomonasaeruginosafacilitate their survival by impeding neutrophil extracellular trap through siglec-9[J]. Leukoc Biol, 2012, 91:641-655.

[12]Crook MA, Pickup JC, Lumb PJ, et al. Relationship between plasma sialic acid concentration and microvascular and macrovascular complications in type 1 diabetes[J]. Diabetes Care, 2001, 24： 316-322.

[13]Khatua B, Ghoshal A, Bhattacharya K, et al. Sias acquired byPseudomonasaeruginosaareinvolved in reduced complement deposition and siglec mediated host-cell recognition[J]. FEBS Lett, 2010, 584：555-561.

[14]Bruns S, Kniemeyer O, Hasenberg M, et al. Production of extracellular traps againstAspergillusfumigatusinvitroand in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA[J]. PLoS pathogens, 2010, 6(4):e1000873.

[15]Dague E, Alsteens D, Latge JP, et al. High-resolution cell surface dynamics of germinatingAspergillusfumigatusconidia[J]. Biophys, 2008, 94:656-660.

[16]Aimanianda V, Bayry J, Bozza S, et al. Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores[J]. Nature, 2009, 460:1117-1121.

[17]Jenne CN, Wong CH, Zemp FJ, et al. Neutrophils recruited to sites of infection protect from virus challenge by releasing neutrophil extracellular traps[J]. Cell host & microbe, 2013, 13:169-180.

[18]Jarrett O. The relevance of feline retroviruses to the development of vaccines against HIV[J]. AIDS research and human retroviruses, 1996, 12:385-387.

[20]Ding J, Chou YY, Chang TL. Defensins in viral infections[J]. Innate Immun, 2009, 1(5) :413-420.

[21]Saitoh T, Komano J, Saitoh Y, et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defence response to human immunodeficiency virus-1[J]. Cell host & microbe, 2012, 12:109-116.

[22]Arrighi JF, Pion M, Garcia E, et al. DC-SIGN-mediated infectious synapse formation enhances X4 HIV-1 transmission from dendritic cells to T cells[J]. Exp. Med, 2004, 200：1279-1288.

Mechanism of Pathogen Escape from Neutrophil Extracellular Traps (NETs)

XIA Jie, WANG Rong

(Med&HealthColl.,HuanggangPolytech.Uni.,Huanggang438000)

Neutrophil extracellular trap (NET) is a new discovered pathogen-resistant mechanism of neutrophil, it is considered to be the important component of the human innate immunity system. However, during the evolution process the pathogens have formed the mechanism of immune escape against NETs. Different pathogens have different NET escaping mechanisms, such as NETs-DNA degradation, surface molecule and modulation of NETosis were briefly introduced in this paper.

neutrophils; neutrophil extracellular traps (NETs); immune escape; pathogen

夏杰 男，主治醫(yī)師。現(xiàn)從事生物化學與免疫學的教學與研究工作。Tel：0713-8346091，E-mail:1787315922@qq.com

2014-10-30；

2015-04-21

Q939.91;R392.1

A

1005-7021(2015)06-0086-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.017