茅新蕾，韓麗雅，黃向東，管朝紅

（溫州市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325000）

·論 著·

eNOS基因rs1799983位點多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性分析

茅新蕾，韓麗雅，黃向東，管朝紅

（溫州市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325000）

目的：研究eNOS基因rs1799983位點多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系。方法：收集2014年5月至9月在我院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的腦梗死患者并進行TOAST分型，其中大動脈粥樣硬化型（LAA）腦梗死患者83例，小動脈閉塞型（SAO）腦梗死患者100例，收集同期體檢中心體檢者91例。應(yīng)用Taqman探針法檢測eNOS基因rs1799983位點多態(tài)性，比較腦梗死患者臨床特征及eNOS基因rs1799983位點多態(tài)性。結(jié)果：與對照組相比，LAA和SAO腦梗死患者高血壓患病率、吸煙及飲酒比例顯著增高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平顯著降低（P＜0.01）。3組rs1799983位點均以GG基因型為主，僅LAA組出現(xiàn)1例TT基因型，3組基因型及等位基因的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：LAA和SAO腦梗死有相似的危險因素，溫州地區(qū)人群eNOS基因rs1799983位點多態(tài)性可能與腦梗死發(fā)生無關(guān)。

腦梗死；單核苷酸，多態(tài)性；一氧化氮合酶，內(nèi)皮型

一氧化氮（NO）參與多種疾病的病理生理過程，其生成主要受NO合酶（NOS）調(diào)節(jié)。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）是NOS的一種亞型，通過降低NO的合成加速動脈粥樣硬化形成，導(dǎo)致缺血性卒中的發(fā)生。本研究對eNOS基因rs1799983（G894T）位點多態(tài)性與缺血性腦血管疾病的關(guān)系進行探討。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2014年5月至9月在我院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的腦梗死患者并進行TOAST分型，收集大動脈粥樣硬化型（large-artery atherosclerosis，LAA）腦梗死患者83例（LAA組）和小動脈閉塞型（small-artery occlusion，SAO）患者100例（SAO組）為病例組，選取同期體檢中心體檢者91例為對照組，所有入組者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①血小板計數(shù)＞450×109/L或＜100×109/L；②血紅蛋白＜9 g/dL；③骨髓增生癥病史；④心房顫動病史；⑤惡性腫瘤病史；⑥對照組排除既往腦卒中者。收集所有研究對象的性別、年齡、煙酒史、既往病史等一般資料，并對患者進行TOAST分型。高血壓病診斷標(biāo)準(zhǔn)為血壓≥140/90 mmHg或正在服用降壓藥物；糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖≥7.0 mmol/L或正在服用降糖藥物；吸煙的標(biāo)準(zhǔn)為≥10支/d；飲酒標(biāo)準(zhǔn)為≥15 g/d。

1.2 方法

1.2.1 血標(biāo)本檢測：利用奧林帕斯5400全自動生化分析儀檢測血脂，包括總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.2.2 全血DNA的提?。红o脈抽取空腹血1 mL，加20 μL EDTA抗凝，-70 ℃冰箱長期保存。收集完成后一次性抽提DNA，相關(guān)試劑由上海生工生物工程公司提供。

1.2.3 eNOS基因rs1799983位點多態(tài)性檢測：應(yīng)用Taqman探針法進行檢測，實驗儀器為LightCycler480 Software Setup（Roche）。引物：rs1799983-FCCCA GGAAACGGTCGC；rs1799983-RTCCCACCCAGTCAATCCCT。探針：rs1799983-FP 5’FAM-GGGATCACTGGGGCCTGCA GCAGCA-3’BHQ1；rs1799983-HP 5’HEX-GGGCTCACTGGG GCCTGCAGCAGC-3’BHQ2。PCR反應(yīng)體系：2×TaqMan Master Mix 10 μL，20×Primer and TaqMan Probe（FAM VIC）dye mix 1 μL，Template DNA 2 μL，ddH2O 7 μL。完成上述步驟后，把加好樣品的384孔板放在LightCycler480 Software Setup（Roche）熒光定量PCR儀進行反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用表示，組間比較用t檢驗和方差分析；組間計數(shù)資料比較用x2檢驗；采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗樣本的群體代表性，基因型和等位基因頻率比較采用x2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組研究對象一般情況比較 3組研究對象高血壓病患病率、吸煙、飲酒、HDL-C水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 3組研究對象一般情況比較（）

表1 3組研究對象一般情況比較（）

3組間比：aP＜0.01

臨床特征LAA組（n=83）SAO組（n=100）對照組（n=91）F/x2P年齡（歲）67.11±12.0466.83±11.2165.66±10.35 0.4200.656a男[ n（%）]50（60.24）66（66.00）45（49.45） 5.4930.064a高血壓[ n（%）]71（85.54）83（83.00）45（49.45）36.9650.000a2型糖尿病[ n（%）]27（32.53）33（33.00）22（24.18） 2.1540.341a吸煙[ n（%）]22（26.51）21（21.00） 4 （4.40）16.5730.000a飲酒[ n（%）]19（22.89）21（21.00） 4 （4.40）13.8690.001aTC（mmoL/L）4.91±1.354.73±1.314.87±1.02 0.5500.579aTG（mmoL/L）1.49±0.591.74±0.921.62±1.07 1.8800.155aHDL-C（mmoL/L）1.19±0.281.19±0.261.32±0.39 5.5400.004aLDL-C（mmoL/L）2.97±1.042.76±0.922.81±0.75 1.2800.279a

2.2 eNOS基因rs1799983位點多態(tài)性 rs1799983：CCTGCTGCTGCAGGCCCCAGATGA[G/T]CCCCCAGAACTCTT CCTTCTGCCCC。T型即A型探針，為FAM標(biāo)記；藍色熒光，表現(xiàn)為X型；G型即C型探針，為HEX標(biāo)記；綠色熒光，表現(xiàn)為Y型；G/T雜合型，為紅色熒光，表現(xiàn)為XY型，見圖1。

2.3 3組研究對象Hardy-weinberg平衡檢驗 3組研究對象eNOS基因rs1799983位點基因型頻率分布符合Hardy-weinberg平衡，樣本具有群體代表性，見表2。

圖1 eNOS基因rs1799983位點基因型

2.4 3組研究對象eNOS基因rs1799983位點基因型比較 3組中僅LAA組出現(xiàn)1例TT基因型，均以GG基因型為主。3組基因型的分布無差異（x2=2.5113，P＞0.05）。3組中T、G等位基因分布亦無差異（x2= 0.1042，P＞0.05），見表3。

2.5 病例組和對照組eNOS基因rs1799983位點多態(tài)性比較 2組中eNOS基因rs1799983位點基因型的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（x2=0.6867，P＞0.05）。2組中T、 G等位基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（x2=0.0490，P＞0.05），見表4。

表2 3組研究對象eNOS基因rs1799983位點基因型Hardy-Weinberg平衡性檢驗

表3 3組研究對象rs1799983位點基因型比較[ n（%）]

表4 病例組和對照組rs1799983位點等位基因型比較[ n（%）]

3 討論

腦梗死是由多種環(huán)境和遺傳因素共同作用所導(dǎo)致的疾病。眾所周知，高血壓、糖尿病、血脂異常、吸煙、酒精、心臟疾病等是腦梗死的危險因素。但這些危險因素對各種卒中亞型影響如何并不明確。我們將LAA、SAO組腦梗死患者相關(guān)臨床特征與體檢者比較發(fā)現(xiàn)，高血壓病患病率、吸煙、飲酒、HDL-C水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但進一步兩兩比較未見上述危險因素在LAA和SAO亞型中的差異。提示大、小各種管徑的動脈病變存在部分相同危險因素[1]。由于本次收集的體檢者基本為老年人，亦存在血管病危險因素，故糖尿病、LDL-C等未見顯著性差別。此結(jié)果提示盡量減少患者可控性血管病危險因素的意義很大。

除環(huán)境因素外，腦梗死與遺傳因素關(guān)系密切。目前，對缺血性腦血管疾病基因的研究多采用候選基因法，與其相關(guān)的候選基因包括NOS基因、血小板相關(guān)基因、脂代謝基因、凝血/纖溶基因、同型半胱氨酸代謝基因等。候選基因成為研究腦梗死遺傳機制的重點。近年來研究[2]發(fā)現(xiàn)，TOAST分型中不同亞型的腦梗死有不同的遺傳易感基因。

NO是腦血管系統(tǒng)中的重要保護因子之一，在NOS催化下生成，不同類型NOS催化生成的NO作用并不相同。目前發(fā)現(xiàn)3種NOS亞型，eNOS主要存在于血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)組織和血小板中，與腦血管疾病的發(fā)生關(guān)系密切，eNOS催化產(chǎn)生的NO具有神經(jīng)保護作用。eNOS由NOS3基因編碼，人類eNOS基因定位于染色體的7q36，全長約21 kb，包含26個外顯子和25個內(nèi)含子。eNOS基因多態(tài)性可影響人體內(nèi)NO的濃度[3]。目前已發(fā)現(xiàn)多種eNOS 基因的多態(tài)性位點，如G894T、A922G、4a/4b等。G894T是其中研究較多的位點之一，位于eNOS基因的第7外顯子894位堿基由G到T的突變，可以導(dǎo)致密碼子第298位的谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘扉T冬氨酸，因改變eNOS的活性而導(dǎo)致NO的活性降低。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，eNOS G894T與缺血性腦卒中顯著相關(guān)，但該位點基因多態(tài)性與不同亞型腦梗死間的關(guān)系目前尚不明確。

本研究結(jié)果顯示LAA組、SAO組及對照組eNOS基因rs1799983（G894T）位點基因型均以GG基因型為主，3組基因型的分布無差異，3組中T、G等位基因分布亦無差異，未發(fā)現(xiàn)G894T等位基因與缺血性腦血管疾病的相關(guān)性。這與Grewal等[5]、Guldiken等[6]研究結(jié)果一致，但亦有研究[7]得出相反結(jié)論。

參考文獻：

[1] 呂洋輝, 何松彬, 唐維國, 等. 頭頸部大動脈粥樣硬化與腦白質(zhì)疏松相關(guān)性分析[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2014, 44(12): 872-876.

[2] Bevan S, Traylor M, Adib-Samii P, et al. Genetic heritability of ischemic stroke and the contribution of previously reported candidate gene and genomewide associations[J]. Stroke, 2012, 43(12): 3161-3167.

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[4] Niu PP, Yang G, Zheng BK, et al. Relationship between endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and ischemicstroke: a meta-analysis[J]. Acta Neurol Scand, 2013, 128(3): 202-212.

[5] Grewal RP, Dutra AV, Liao YC, et al. The intron 4c allele of the NOS3 gene is associated with ischemic stroke in African American[J]. BMC Med Genet, 2007, 10(8): 76.

[6] Guldiken B, Sipahi T, Guldiken S, et al. Glu298Asp polymorphism of the endothelial nitric oxide synthase gene in Turkish patients with ischemic stroke[J]. Mol Biol Rep, 2009, 36(6): 1539-1543.

[7] 章志量, 魏丹宏, 沈榮林, 等. 內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因G894T突變與腦梗死的相關(guān)研究[J]. 健康研究, 2009, 29(3): 180-183.

（本文編輯：吳彬）

The correlative analysis of eNOS rs1799983 single-nucleotide polymorphisms and cerebral infarction

MAO Xinlei, HAN Liya, HUANG Xiangdong, GUAN Chaohong. Department of Neurology, Wenzhou Central Hospital, Wenzhou, 325000

Objective: To investigate the relationship of eNOS rs1799983 single-nucleotide polymorphisms (SNP) and cerebral infarction. Methods: Data was prospectively collected from consecutive ischemic stroke inpatients in neurology department of our hospital from may 2014 to september 2014. Eighty-three large-artery atherosclerosis (LAA) patients and small-artery occlusion (SAO) patients in 100 patients were enrolled, according to the TOAST criteria. The control group was 91 subjects from the Medical Examination Center at the same period. Taqman probe technique was used for the detection of eNOS rs1799983 SNP. The clinical characteristics and eNOS rs1799983 SNP were compared between three groups. Results: As compared with the controls, there were statistically signifcant differences in percentage of HBP, smoking, drinking, high-density lipoprotein and cholesterol concentrations in LAA and SAO groups (P＜0.01). The GG genotype was main genotype in three groups. Only 1 case TT genotype was observed in LAA group. The frequency of allele and genotype was not signifcantly difference in these three groups. Conclusion: It is suggested that there are similar risk factors in LAA and SAO patients. The eNOS rs1799983 SNP maybe unrelated to cerebral infarction.

cerebral infarction; polymorphism, single nucleotide; endothelial nitric oxide synthase

R743.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.09.006

2014-11-27

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2011KYA148）。

茅新蕾（1975-），男，江蘇南通人，副主任醫(yī)師，碩士。通信作者：韓麗雅，主任醫(yī)師，Email：wzeyhly@163.com。