吳樂燦，吳金明，藍松松，林賢凡，王秀燕，張騰，黃智銘，吳建勝

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.消化內(nèi)科；2.肝膽外科）

·論 著·

HBeAg對小鼠骨髓源性樹突狀細胞細胞因子分泌及其PI3K-Akt信號通路的影響

吳樂燦1，吳金明1，藍松松1，林賢凡1，王秀燕1，張騰2，黃智銘1，吳建勝1

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.消化內(nèi)科；2.肝膽外科）

目的：探討乙型肝炎e抗原（HBeAg）對小鼠骨髓源性樹突狀細胞（DCs）細胞因子分泌及其PI3KAkt信號通路的影響。方法：分離C57BL/6小鼠骨髓細胞，體外誘導(dǎo)為未成熟樹突狀細胞（DCs），經(jīng)CD11c磁珠分選純化并用LPS刺激成熟后，分成3組：空白組、OVA組和HBeAg組。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測各組培養(yǎng)上清中IL-12p70和IL-10的分泌，用混合淋巴細胞反應(yīng)（MLR）和Western blot法分別檢測各組DCs刺激T淋巴細胞增殖能力以及細胞內(nèi)Akt磷酸化水平。結(jié)果：HBeAg組上清液中IL-12p70分泌水平以及DCs刺激T淋巴細胞增殖能力較空白組和OVA組明顯降低（P＜0.05），而IL-10分泌水平及DCs細胞內(nèi)Akt的磷酸化水平較其余2組明顯升高，差異均具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：HBeAg能夠減弱DCs的免疫功能，抑制后者分泌IL-12的同時，增加IL-10的分泌。這些改變可能與PI3K-Akt信號通路的激活有關(guān)。

乙型肝炎e抗原；樹突狀細胞；白介素12；白介素10；信號通路；小鼠

目前全世界超過20億人感染過乙型肝炎病毒（HBV），其中約3.5億為慢性HBV感染者[1]。我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，HBV攜帶率為10%，慢性HBV感染患者約3 500萬。然而當(dāng)前慢性乙型肝炎仍缺乏有效的治療措施，我國每年有超過100萬的患者死于肝硬化和肝癌等HBV相關(guān)肝病。樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）作為體內(nèi)最強的專職抗原遞呈細胞，能夠直接激活T細胞，進而啟動一系列免疫反應(yīng)，在抗病毒免疫方面起著關(guān)鍵作用[2]。以往研究表明，DCs的功能缺陷將導(dǎo)致其不能有效地將抗原遞呈給T淋巴細胞，從而導(dǎo)致異常的體液免疫和細胞免疫，而這可能與乙型肝炎慢性化存在密切聯(lián)系[3-5]。作為免疫調(diào)節(jié)蛋白，HBeAg參與并在乙型肝炎慢性化過程中起重要作用[6]。近年來研究表明，DCs中PI3K-Akt信號通路的活化，能抑制DCs成熟，降低后者IL-12的分泌并促進IL-10分泌[7-9]。本研究通過體外HBeAg刺激正常小鼠骨髓源性DCs，觀察DCs功能、細胞因子分泌和PI3K-Akt信號通路的變化，進一步探討HBeAg在HBV感染慢性化中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：正常C57BL/6小鼠，6～8周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，無特定病原菌級。

1.1.2 主要試劑：HBeAg、卵清蛋白（OVA）購自北京科衛(wèi)試劑公司，RPMI-1640、胎牛血清購自美國Gibico公司，重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（rmGM-CSF）以及重組小鼠白細胞介素-4（rmIL-4）購自美國PeproTech公司，CDllc microbeads、磁柱購自德國Miltenyi Biotec公司，兔抗小鼠單克隆抗體CD11c-別藻藍蛋白（APC）及同型對照購自美國BioLegend公司，小鼠IL-12p70和IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自美國RD公司，CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所，兔抗鼠p-Akt和Akt單克隆抗體購自Abcam公司，GAPDH單克隆抗體購自杭州賢至生物科技有限公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6小鼠骨髓DCs分離培養(yǎng)及純化：取C57BL/6小鼠麻醉后用頸椎脫臼法處死，于75%乙醇中浸泡3～5 min，無菌條件下分離并取出小鼠股骨和脛骨，在超凈工作臺中用吸取RPMI-1640的1 mL注射器反復(fù)沖洗骨髓腔，直至顏色變白。100目濾網(wǎng)過濾，加入紅細胞裂解液溶解紅細胞，1 200 r/min離心10 min，去除上清，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、rmGM-CSF 10 ng/mL、rmIL-4 2 ng/ mL、1%青鏈霉素混合液）調(diào)整細胞濃度至106/mL，接種于6孔培養(yǎng)板中，37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h貼壁后，去除非貼壁細胞，補足完全培養(yǎng)液。隔日半量換液。細胞培養(yǎng)至第6天時，收集懸浮和半貼壁細胞，使用MiniMACS免疫磁珠分選系統(tǒng)，按試劑說明書分選CD11c+細胞，即為純化DCs。使用APC標(biāo)記的小鼠CDllc單克隆抗體以及相應(yīng)同型對照，流式檢測DCs純度。純化DCs用LPS（100 ng/mL）刺激24 h，成為成熟DCs。

1.2.2 HBeAg刺激實驗及分組：將成熟DCs分為3組，即加入HBeAg（5 μ g/mL）刺激24 h，為HBeAg組；加入等量OVA無關(guān)蛋白刺激24 h，為OVA組；另設(shè)空白組，加入等量RPMI-1640培養(yǎng)基。收集各組細胞行后續(xù)實驗。

1.2.3 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液IL-12p70和IL-10分泌水平：取各組DCs培養(yǎng)上清液，使用ELISA試劑盒，按試劑盒說明書測定IL-12p70和IL-10含量。酶標(biāo)儀于波長450 nm處檢測出樣品的A值，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上換算出對應(yīng)細胞因子的含量。

1.2.4 Western blot法測定：DCs內(nèi)Akt磷酸化水平：收集各組DCs，用裂解緩沖液提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，每個樣本取30 μ g蛋白，經(jīng)SDSPAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。封閉2 h，分別加入兔抗p-Akt、Akt和GAPDH（1∶1 000稀釋），4 ℃過夜，TBS-T洗膜（10 min，3次），再加入山羊抗兔的二抗（1∶5 000稀釋），孵育2 h，TBS-T洗3次后，ECL試劑盒顯色。底片經(jīng)掃描儀透掃后，用Quantity One軟件進行定量分析。

1.2.5 同種異體混合淋巴細胞反應(yīng)（MLR）檢測DCs刺激T淋巴細胞增殖的能力：制備BALB/c小鼠脾臟細胞懸液，經(jīng)自行制備的T淋巴細胞尼龍毛柱分離T細胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至1×106/mL作為應(yīng)答細胞。將各組DCs重懸于RPMI-1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞密度為2×105/mL，加入終濃度為25 μ g/ mL的絲裂霉素C，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS洗2次，再用完全RPMI-1640培養(yǎng)液重懸成5×105/mL，作為刺激細胞。將BALB/c小鼠脾T淋巴細胞和各組DCs加入96孔板共培養(yǎng)，每孔加入淋巴細胞100 μ L，然后分別加入40、20、10 μ L的DCs（DCs/T比值分別為1∶5、1∶10、1∶20），每種混合比例各設(shè)3個復(fù)孔，加培養(yǎng)液至總體積200 μ L，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育96 h。另設(shè)只含淋巴細胞的孔為對照組，含RPMI-1640的孔為本底組。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔各加入CCK-8試劑20 μ L，繼續(xù)孵育4 h，振蕩混勻后，于參比波長650 nm、檢測波長450 nm處測定其吸光度（OD）。重復(fù)3次，刺激結(jié)果用刺激指數(shù)（stimulating index，SI）均值表示。SI=（實驗組OD值-本底OD值）/（對照組OD值-本底OD值）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。結(jié)果以表示。3組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨髓源性DCs純度鑒定 流式檢測結(jié)果顯示，用免疫磁珠法純化后，CDllc+細胞陽性率達到90%以上，此DCs純度可滿足進一步實驗的需要，見圖1。

圖1 免疫磁珠分選后CD11c陽性細胞比例

2.2 細胞培養(yǎng)上清液中IL-12p70和IL-10分泌水平

經(jīng)ELISA法檢測，空白組、OVA組和HBeAg組IL-12p70分泌量分別為（86.73±8.68）pg/mL、（88.17± 7.44）pg/mL和（62.85±8.63）pg/mL，應(yīng)用LSD檢驗行組間多重比較，表明經(jīng)HBeAg干預(yù)后，DCs分泌IL-12的能力明顯降低，與其他2組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為-4.568和-4.843，均P＜0.05），空白組和OVA組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t= -0.275，P＞0.05）（見圖2A）。相反地，HBeAg組IL-10表達水平為（44.27±5.49）pg/mL，明顯高于空白組的（34.92±7.36）pg/mL和OVA組的（34.29±7.04）pg/mL（t值分別為2.213和2.363，均P＜0.05），空白組與OVA組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.150，P＞0.05）（見圖2B）。

圖2 各組DCs上清液IL-12和IL-10分泌水平

2.3 Western blot法測定Akt的磷酸化水平 為探索HBeAg對DCs細胞內(nèi)信號通路的影響，我們對各組細胞p-Akt和Akt的表達進行了Western blot法檢測。以p-Akt作為目的蛋白，Akt作為參照蛋白，使用灰度值進行定量分析，分別計算各組p-Akt/Akt比值作為最終統(tǒng)計指標(biāo)。3組灰度值比值分別為空白組（0.493±0.025）、OVA組（0.480±0.076）、HBeAg組（0.881±0.171）。方差齊性檢驗示方差齊（F=4.051，P＞0.05），LSD檢驗行組間兩兩比較。結(jié)果顯示，HBeAg組p-Akt/Akt明顯高于其余2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為4.338和4.487，P均＜0.05），空白組和OVA組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.149，P＞0.05），見圖3。

圖3 各組DCs中p-Akt和Akt表達量

2.4 DCs刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力 在混合淋巴細胞反應(yīng)中，3組DCs刺激淋巴細胞增殖的能力隨DCs/T比例增高而增高。DCs/T比例為1∶5、1∶10和1∶20時HBeAg組DCs刺激淋巴細胞增殖能力低于空白組和OVA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為-4.233和-4.305，-3.262和-3.334，-2.292和-2.547，均P＜0.05）?？瞻捉M和OVA組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為-0.072，-0.719，-0.255，均P＞0.05），見圖4。

圖4 混合淋巴細胞反應(yīng)中DCs對T細胞增殖的影響

3 討論

HBV感染后不同的臨床結(jié)局很大程度上取決于機體對HBV感染的免疫反應(yīng)，病毒的復(fù)制和不適當(dāng)?shù)乃拗髅庖邞?yīng)答將導(dǎo)致HBV的慢性感染?，F(xiàn)觀點認為，HBV能躲避宿主免疫系統(tǒng)的清除，誘導(dǎo)宿主對HBV免疫耐受而得以持續(xù)感染[10-11]。DCs屬于專職抗原提呈細胞，能夠有效識別病毒等病原體，在抗病毒免疫中起重要作用，其擁有獨特的激活初始T細胞能力，能夠有效地將固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答連接起來[12]。各種慢性病毒能以DCs作為靶點進行免疫逃避[13]。在HBV存在的情況下，DCs的功能缺陷可能導(dǎo)致耐受性T細胞應(yīng)答和HBV持續(xù)感染狀態(tài)。此外，DCs本身分泌的Th1型細胞因子（如IL-12）和Th2型細胞因子（如IL-10）比例的失衡也將為HBV慢性感染創(chuàng)造有利環(huán)境[14-16]。以往研究[17-18]表明，相對于健康人，慢性乙型肝炎患者的髓樣DCs的進一步成熟能力受損，表現(xiàn)為上調(diào)共刺激分子、產(chǎn)生促炎癥細胞因子和刺激T細胞的能力下降。

HBeAg不是病毒復(fù)制和感染所必需的，但卻是建立慢性感染所必需的，能在慢性感染階段對宿主免疫應(yīng)答進行免疫調(diào)節(jié)[19]。有學(xué)者[20]報道，HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者外周血DCs受聚肌胞刺激后TLR3表達異常，協(xié)同刺激因子CD86表達低下。HBeAg導(dǎo)致慢性乙型肝炎患者外周血Thl/Th2型細胞因子失衡，有利于形成對HBV感染的免疫耐受[21]。而用HBe（385-420）基因與CD40L胞外段基因融合所構(gòu)建的真核表達載體能夠顯著促進DCs成熟，增強DCs功能[22]。這些研究均表明，HBeAg可能是造成慢性HBV感染者體內(nèi)免疫耐受和促使病毒持續(xù)感染的關(guān)鍵因素。本研究通過體外HBeAg刺激小鼠骨髓來源DCs，觀察DCs功能、細胞因子分泌和PI3K-Akt信號通路的變化，結(jié)果顯示HBeAg組DCs的IL-12表達水平較空白組和OVA組明顯降低，而IL-10的表達則較其他2組明顯升高。在混合淋巴細胞反應(yīng)中，HBeAg組DCs刺激T細胞增殖的能力明顯低于其他2組。上述結(jié)果提示，HBeAg能夠引起DCs功能低下，并且通過抑制DCs本身IL-12分泌及促進其IL-10分泌，造成Thl/Th2型細胞因子失衡。

磷脂酞肌醇3-激酶（PI3K）家族參與多種信號通路，調(diào)節(jié)細胞的主要功能。PI3K-Akt信號通路在許多人類腫瘤譜中失調(diào)，與腫瘤細胞躲避機體免疫監(jiān)視和造成機體免疫耐受方面緊密相關(guān)。PI3K首次被Arbibe等[23]證實在TLRs信號網(wǎng)絡(luò)中，能抑制TLR2介導(dǎo)的NF-κB的活化，阻斷NF-κB啟動下游炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達。近年來研究表明，PI3K是 DCs產(chǎn)生IL-12的內(nèi)源性抑制劑[24]，對DCs的IL-12的合成起負性調(diào)節(jié)作用，而對IL-10的合成起正性調(diào)節(jié)作用[7，25]。作為抑制性因子，升高的IL-10抑制Th1細胞免疫應(yīng)答，降低機體的抗病毒能力[26]。本研究Western blot法檢測結(jié)果顯示，相對于空白組和OVA組，HBeAg組DCs中Akt的磷酸化水平明顯增高，表明HBeAg能夠激活A(yù)kt信號通路。我們推測該通路的活化與細胞因子IL-12和IL-10檢測結(jié)果可能存在相關(guān)性，確切關(guān)系仍需進一步實驗研究。

綜上所述，HBeAg一方面可能通過影響DCs中的PI3K-Akt信號通路，促進IL-10和抑制IL-12的表達，造成Thl/Th2型細胞因子失衡，致使無法產(chǎn)生有效的Th1型抗病毒免疫反應(yīng)；另一方面可能通過減弱DCs刺激T細胞的能力，導(dǎo)致機體不能產(chǎn)生強有力的抗病毒特異性T細胞免疫，引起對HBV的免疫耐受，從而使感染慢性化。但HBeAg是通過何種方式作用于PI3K-Akt通路以及DCs中IL-12和IL-10的表達改變是否與PI3K-Akt通路存在明確相關(guān)性，尚待進一步研究。

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（本文編輯：吳健敏）

Effect of hepatitis B e antigen on the cytokine secretions and PI3K-Akt signaling pathway of mouse bone marrow-derived dendritic cells

WU Lecan1, WU Jinming1, LAN Songsong1, LIN Xianfan1, WANG Xiuyan1,ZHANG Teng2, HUANG Zhiming1, WU Jiansheng1.
1.Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To investigate the effect of HBeAg on cytokine secretions and PI3K-Akt signaling pathway of mouse bone marrow-derived dendritic cells. Methods: The murine bone marrow cells were cultured and induced in vitro into DCs. Then the DCs were purifed by murine CD11c microbeads and were matured overnight with LPS (100 ng/mL) to generate mature DCs. All the DCs were classifed into three groups randomly, the control group, the OVA group and the HBeAg group. The secretions of IL-12p70 and IL-10 in DCs of all groups and the ability of three groups to stimulate allogenic T cell proliferation were detected by the enzymelinked immunosorbent assay and the Mixed Lymphocyte Reaction, respectively. Then the western blot was used to detect the phosphorylation of Akt in three DCs groups. Results: After the HBeAg intervention, the expression of IL-12p70 in DCs and the stimulating T cell proliferation ability of DCs were signifcantly decreased compared to the other two groups (P＜0.05), whereas the secretion of IL-10 and the phosphorylation of Akt in DCs were signifcantly increased (P＜0.05). Conclusion: HBeAg may exploit PI3K-Akt signaling pathway as a strategy to suppress the immune response of DCs by inhibiting the secretion of IL-12 and increasing the secretion of IL-10.

hepatitis B e antigen; dendritic cells; interleukin-12; interleukin-10; signaling pathway; mice

R512.6

ADOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.03.004

2014-11-27

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LY12H03003，Y2110 768）。

吳樂燦（1989-），男，浙江樂清人，碩士生。

吳金明，主任醫(yī)生，碩士生導(dǎo)師，Email：wzfydw@ 163.com。